Universidad de Costa Rica Facultad de Farmacia Informe de Proyecto de Graduación Elaboración de un estudio de reformulación de una suspensión de antibióticos de uso veterinario para Laboratorios FARYVET S.A. Estudiante: Melissa Camacho Solís Carné: B01235 Integrantes del Comité Asesor: Dr. Jorge A. Pacheco Molina Máster Jessica Morera Huertas Dra. Laura Ramírez Chinchilla 2019 Dr. Jorge A. Pacheco Malina Director del Proyecto Máster Je,Morera Huertas Asesora del Proyecto '"�✓ Dra. Laura Ramirez Chinchilla Asesora del Proyecto 11 I , H -H 1 1.1 1 tt LV-J Dr. or,4,an Hidalgo Muñoz Lector del Proyecto Dr. Lector del Proyecto Melissa Camacho Salís Estudiante 2 RESUMEN Cita Bibliográfica Completa Camacho Solís M (2019). Elaboración de un estudio de reformulación de una suspensión de antibióticos de uso veterinario para FARYVET S.A. Informe de Proyecto de Graduación para optar por el grado de Licenciatura en Farmacia. Sede Universitaria Rodrigo Facio, San José, Costa Rica. Descriptores SUSPENSIONES, MEDICAMENTOS VETERINARIOS, ANTIBACTERIANOS, TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA Las suspensiones, por su naturaleza, son físicamente inestables y en determinado momento la sedimentación de los sólidos se dará de manera inevitable, por lo que representan un desafío en la formulación de productos farmacéuticos. La facilidad con la que se dé la redispersión de estos sólidos es un factor clave en la evaluación de cualquier formulación. Los aspectos de tamaño de partícula, las diferentes interacciones involucradas y la viscosidad del medio dispersante son parte de un complejo equilibrio que requiere del análisis del producto y sus componentes. Los esfuerzos de regulación en la industria farmacéutica veterinaria nacional propician la necesidad de la evaluación de productos y fórmulas establecidas con respecto a su estabilidad y calidad. El propósito de este proyecto fue desarrollar una reformulación para un producto veterinario en suspensión que contiene sulfato de neomicina 2,20 mg/mL, sulfaguanidina 66,71 mg/mL, sulfadiazina 6,00 mg/mL y sulfamerazina 6,00 mg/mL con el fin de mejorar su calidad. El proyecto se dividió en cuatro etapas. La primera etapa comprendió en la revisión de bibliografía relacionada a la estabilidad de suspensiones y de los registros existentes en Faryvet S.A. correspondientes al producto. La segunda parte del proyecto consistió en la reformulación del producto por medio de la información 3 recolectada en la etapa anterior. La tercera etapa fue la fabricación de lotes piloto para recolectar datos de pre-estabilidad y en la creación de los documentos necesarios con los cuales la compañía podrá iniciar un estudio acelerado de estabilidad. La última etapa se relacionó con la revisión de la metodología analítica existente para el producto, con el fin de completarla con los análisis requeridos para el estudio de estabilidad y los controles de los lotes de producción. Como parte del proyecto se creó documentación correspondiente para análisis que no eran realizados por el laboratorio como lo son la determinación de la viscosidad y la cromatografía de capa fina. Además, se añaden cambios al proceso de manufactura y se recomienda realizar esfuerzos con respecto a la cultura de documentación del fabricante. También se generan protocolos relacionados a la validación de los análisis de cuantificación de sulfonamidas y límite microbiano con los cuales no se contaban al iniciar el proyecto. Finalmente se insta al laboratorio fabricante continuar en establecimiento de mejoras para el aseguramiento de la calidad en todas sus operaciones. 4 Índice Problema de Estudio y Justificación ........................................................................ 6 Objetivo General y Específicos ............................................................................... 10 Marco Teórico ........................................................................................................... 11 Medicamentos Veterinarios ..................................................................................... 11 Generalidades de la Suspensión a Reformular ....................................................... 13 Conceptos Generales de Antibióticos .................................................................. 14 Neomicina ............................................................................................................ 15 Sulfonamidas ....................................................................................................... 21 Caolín y Pectina ................................................................................................... 27 Suspensiones .......................................................................................................... 30 Generalidades ..................................................................................................... 31 Conceptos Físico Químicos Relevantes .............................................................. 32 Formulación de una Suspensión ........................................................................ 37 Estudios de Estabilidad en Suspensiones ........................................................... 48 Metodología .............................................................................................................. 51 Resultados y Discusión ........................................................................................... 58 Análisis Crítico de la Fórmula Original ................................................................... 58 Justificación de la Fórmula ...................................................................................... 61 Estudio de Reformulación y Análisis de la Metodología Analítica ........................... 63 Idoneidad de la Especificación del pH ................................................................. 63 Capacidad Amortiguadora ................................................................................... 64 Comportamiento Reológico y Especificación de Viscosidad .............................. 66 Especificación de Densidad ................................................................................. 69 Identificación de Principios Activos ...................................................................... 69 Determinación de la Potencia Microbiológica ...................................................... 75 Modificaciones al Proceso de Manufactura ......................................................... 77 Estudios de Pre-estabilidad..................................................................................... 83 Documentación Relacionada con el Producto ........................................................ 88 Conclusiones ............................................................................................................ 88 Recomendaciones .................................................................................................... 89 5 Bibliografía ................................................................................................................ 90 Anexos .................................................................................................................... 104 Diagrama de Ishikawa ........................................................................................... 105 6 1. Problema de estudio y justificación. La entrada en vigencia del Reglamento Técnico Centroamericano correspondiente al ámbito de los medicamentos veterinarios, por medio de la publicación de la Resolución No 257-2010 del RTCA 65.05.51:08, los requerimientos de registro sanitario y control estatal de los medicamentos veterinarios, produce un cambio en los requisitos a cumplir por parte de los laboratorios fabricantes. Esto genera una obligación que recae en los laboratorios de productos veterinarios nacionales, la cual se derivada del interés de continuar con la comercialización de sus productos. Dicho interés lleva a empresas como FARYVET SA a la identificación de aspectos de mejora en sus productos y la solicitud de apoyo técnico en el campo farmacéutico. El medicamento con el que se trabajó en este proyecto fue una suspensión de uso veterinario para especies domésticas, cuyos principios activos son Sulfato de neomicina 2,20 mg/mL, Sulfaguanidina 66,71 mg/mL, Sulfadiazina 6,00 mg/mL y Sulfamerazina 6,00 mg/mL, con la adición de caolín y pectina, el cual se utiliza para el tratamiento de diarreas y enteritis de origen bacteriano, según lo establecido por el fabricante. La formulación original presenta una combinación de 4 antibióticos y es comercializada en el país. La Dirección de Medicamentos Veterinarios como órgano adscrito al Servicio Nacional de Salud Animal (SENASA) “es la encargada de registrar, controlar, regular y supervisar los medicamentos veterinarios de manera que no representen un peligro para la salud pública, la salud animal y el medio ambiente”. Es el organismo competente en quien recae la implementación y vigilancia de los requisitos establecidos por la nueva regulación de medicamentos veterinarios (SENASA, sf). Con la entrada en vigor del RTCA 65.05.51:08 es necesario justificar las ventajas de utilizar dicha combinación de antibióticos y de no encontrarse una justificación pertinente, según los usos propuestos, reformular el producto. Las exigencias y la vigilancia actual con respecto a la calidad (Yu et al., 2014), generan la 7 necesidad de los fabricantes de productos veterinarios, de trabajar en la mejora de los productos para lograr el cumplimiento de los nuevos requisitos. En este estudio se buscó mejorar aspectos fisicoquímicos de la formulación para maximizar la estabilidad del producto y facilitar los análisis de calidad requeridos, como respuesta a las necesidades expresadas por el fabricante. El producto seleccionado cuenta con problemas de resuspendibilidad, lo cual no solo interfiere con la administración y dosificación del producto, sino que presenta problemas a la hora de realizar el control de calidad. Con el objetivo de optimizar dicha formulación se realizó un estudio documental y bibliográfico para determinar los problemas presentados en la fabricación y sus causas raíz con el fin de direccionar los esfuerzos hacia la mejora del producto y procesos relacionados con su fabricación. Este producto presenta una combinación de principios activos de naturaleza antimicrobiana por lo que es de suma importancia verificar su uso adecuado, además de proporcionar al usuario final los niveles de calidad y seguridad correspondientes a la mejora de los procesos infecciosos, sin generar impacto ambiental o minimizándolo. Tradicionalmente se le confiere el mayor impacto de la resistencia antimicrobiana al uso indiscriminado de fármacos en animales de producción, ya sea para incrementar su crecimiento o como profilaxis en caso de infecciones por microorganismos (Lloyd, 2007). Como consecuencia, se ha dejado de lado el impacto que tiene el uso indiscriminado de antibacterianos en mascotas o animales de compañía, ya que muchas veces se ignora que las mascotas pueden actuar como reservorios de microorganismos resistentes cuando se dá un tratamiento inadecuado de las infecciones. La relación tan cercana entre los dueños y sus mascotas pueden propiciar la transmisión de estos organismos a los humanos, especialmente por medio de la piel o la saliva. Incluso el tratamiento utilizado en estas infecciones puede ser similar al utilizado en humanos, provocando que se genere una resistencia 8 y reduzca las opciones para el tratamiento en infecciones especialmente complicadas en humanos (Smith et al., 2018). La resistencia a los antimicrobianos, también llamada farmacorresistencia, se produce cuando los microorganismos (bacterias, virus, hongos o incluso parásitos) sufren cambios como mutaciones que provocan que los medicamentos utilizados para las infecciones dejen de ser eficaces. Esta se produce en respuesta al uso continuo de estos fármacos. Los microorganismos multirresistentes pueden provocar infecciones graves y letales si no se tratan oportunamente. La multirresistencia implica generar resistencia a varias familias de antibióticos (Saldarriaga et al., 2015). La situación puede llegar a ser muy crítica ya que, algunas de estas bacterias pueden adquirir resistencia a carbapenémicos y cefalosporinas de tercera y cuarta generación, las cuales están entre las mejores opciones disponibles para tratar las bacterias multirresistentes (Valdés y Ángel, 2017). Se han identificado reportes de organismos multirresistentes de posible transmisión zoonótica por parte de animales de compañía (perros, gatos e incluso caballos) como Staphylococcus aureus y Staphylococcus pseudintermedius meticilino resistente, Enterococcus spp, enterobacterias productoras de β-lactamasas de amplio espectro (ESBL por sus siglas en inglés), Acinetobacter baumannii, Campylobacter spp, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp, y Clostridium difficile (Rendle y Page, 2018). La problemática de la transmisión zoonótica de estas bacterias se puede clasificar por su impacto directo en la transmisión del organismo resistente en sí o en la transmisión indirecta como sería el caso de la transmisión de genes y factores de resistencia transferidos entre bacterias humanas y animales (Pomba et al., 2017). Es importante implementar medidas para la reducción del uso irracional de antimicrobianos. Sin embargo, esto se dificulta si se ofrecen opciones comerciales cuyos usos no se encuentren claramente justificados en animales o que por su naturaleza promueven su uso indiscriminado. Por esta razón, la mejora en el control 9 de estos productos desde su producción y su oferta comercial implican la necesidad de promover su uso racional. Destaca también en este sentido la importancia del profesional farmacéutico en la producción de acuerdo con normas de correcta fabricación y en la utilización de estos productos en todos sus ámbitos. 10 2. Objetivos 2.1. Objetivo General Desarrollar una reformulación para un producto veterinario en suspensión que contiene sulfato de neomicina 2,20 mg/mL, sulfaguanidina 66,71 mg/mL, sulfadiazina 6,00 mg/mL y sulfamerazina 6,00 mg/mL con el fin de mejorar su calidad. 2.2. Objetivos Específicos 2.2.1. Determinar los problemas de estabilidad física y química del producto original mediante una revisión bibliográfica y el estudio de los registros de producción, análisis realizados anteriormente y otros documentos relacionados. 2.2.2. Desarrollar un estudio de reformulación partiendo de la fórmula original con el fin de evaluar y definir la fórmula cualitativa - cuantitativa para los lotes piloto de estabilidad del producto reformulado. 2.2.3. Establecer el método de fabricación para la fórmula definitiva de los lotes piloto que sirva como base para los lotes industriales. 2.2.4. Establecer las pruebas analíticas requeridas para el control de calidad y el estudio de estabilidad del producto reformulado. 11 3. Marco teórico. 3.1. Medicamentos Veterinarios Según la Ley General de Salud en su artículo 104, se establece que un medicamento es: “toda sustancia o productos naturales, sintéticos o semi-sintéticos y toda mezcla de esas sustancias o productos que se utilicen para el diagnóstico, prevención, tratamiento y alivio de las enfermedades o estados físicos anormales, o de los síntomas de los mismos y para el restablecimiento o modificación de funciones orgánicas en las personas o en los animales”. También en el artículo 96 de esta misma ley se establece que los establecimientos que estén relacionados con la producción, manejo y venta de medicamentos de uso veterinario de forma exclusiva pueden ser regentados por un Médico Veterinario (Asamblea Legislativa, 1974). Esta regencia supone la dirección técnica y científica, además la responsabilidad de todo lo relacionado a la identidad, pureza y buen estado de los productos farmacéuticos que sean elaborados, preparados, manipulados, almacenados y suministrados en dichos establecimientos. Incluso se establece que estos establecimientos requieren permisos y el debido registro en el Colegio de Médicos Veterinarios (Asamblea Legislativa, 1974). Por su parte la resolución Nº SENASA-DG-R011-2009, establece que tiene competencia el Servicio Nacional de Salud Animal (SENASA, 2009) como parte del Ministerio de Agricultura y Ganadería (MAG), para el control y la garantía en cuanto a la salud de los animales de diferentes especies y por lo tanto de productos, subproductos y derivados para consumo humano o animal y los controles sanitarios de los establecimientos relacionados. Según el Reglamento General para el otorgamiento del Certificado Veterinario de Operación, Decreto 34859-MAG, este certificado es requerido para la debida 12 operación de establecimientos que “elaboren, importen, almacenen, fraccionen, almacenen, transporten y vendan medicamentos veterinarios, sustancias peligrosas para la salud ambiental y químicos para los alimentos de origen animal”. El decreto ejecutivo 28861 del Ministerio de Agricultura y Ganadería se refiere al registro y control de medicamentos veterinarios y define los establecimientos farmacéuticos veterinarios. También, el documento amplía la definición de medicamento veterinario al agregar los aditivos con propiedades farmacológicas, tales como: anticoccidios, antibióticos, promotores de crecimiento, plaguicidas y alimentos medicados (MAG, 2001). En este decreto también se estipula la creación del Departamento de Medicamentos Veterinarios, entidad cuyas funciones incluyen lo referente al registro de medicamentos veterinarios, además de las inspecciones a los establecimientos farmacéuticos veterinarios. Para efectos del registro de medicamentos veterinarios existe una clasificación: Grupo 1: Medicamentos de uso restringido (Estupefacientes y Psicotrópicos). Grupo 2: Medicamentos de uso restringido por receta de Médico Veterinario. Grupo 3: Medicamentos de venta exclusiva en establecimientos farmacéuticos veterinarios. Dentro de este grupo se incluyen los antibióticos y otros antibacterianos como antihelmínticos y antiprotozoarios. Grupo 4: Medicamentos de venta libre en cualquier local comercial autorizado. En el caso de medicamentos veterinarios con combinaciones de principios activos, según el RTCA 65.05.51:08 se deben demostrar las ventajas de la combinación por medio de estudios científicos que sustenten las ventajas farmacológicas en combinación comparándolas con sus eficacias de manera separada. Esto se cumple con el fin de que su uso conjunto no incremente los riesgos para la salud humana, el medio ambiente y que no promueva factores de 13 resistencia microbiológica (Poder Ejecutivo, 2015). Según esto se requiere demostrar: 1. Que existe un efecto sinérgico o de potenciación, mejorando la actividad terapéutica. 2. Que se amplía el espectro o el rango de acción contra varios agentes en enfermedades o problemas de salud ocasionados por varios agentes. 3. Que la adición mejora o disminuye los efectos adversos o colaterales, o permite el uso efectivo de menores cantidades de principio activo. 4. Que se produce una mejora en el perfil farmacocinético y farmacodinámico. Estas combinaciones de fármacos deben estar respaldadas por documentación que justifique las indicaciones de uso para las cuales es necesaria para lograr un efecto terapéutico, la idoneidad con respecto a la proporción entre los principios activos que contiene el producto y la inexistencia de antagonismos entre los componentes activos (Poder Ejecutivo, 2015). 3.2. Generalidades de la Suspensión de Antibióticos a reformular El producto a reformular consiste en una suspensión de los antibióticos de sulfato de neomicina en concentración de 2,20 mg/mL y tres sulfonamidas que incluyen: 66,71 mg/mL de sulfaguanidina, con 6,00 mg/mL sulfadiazina e igual concentración de sulfamerazina. Además de los antibióticos, contiene una combinación de excipientes de los cuales son importantes el caolín y la pectina cuyo uso se ha asociado como coadyuvante en casos de enteritis bacteriana, que es la indicación principal de este producto. La enteritis de origen bacteriano en mascotas se ha visto relacionada principalmente a la presencia de enteropatógenos como Clostridium spp, Salmonella spp, Campylobacter jejuni y Escherichia coli, esta última ha sido asociada específicamente con colitis granulomatosa (GC). La GC se da con mayor prevalencia en perros de raza Bóxer, Bulldog francés y Border Collie (Marks et al., 2011). 14 Las siguientes secciones pretenden analizar los diferentes componentes de la fórmula original, una descripción de su mecanismo de acción, generalidades y su uso en la práctica veterinaria. 3.2.1. Conceptos Generales de Antibióticos En esta sección se definirán algunos conceptos básicos relacionados con la temática de antibióticos y microbiología clínica que se relacionan directamente con la naturaleza del producto analizado. Entre los conceptos se encuentran la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) y la diferencia entre los fármacos bacteriostáticos y bactericidas. La CIM se refiere a la concentración de un antibiótico necesaria para inhibir el crecimiento de un inóculo (número estandarizado de microorganismos) en determinadas condiciones. La CIM permite conocer la cantidad probable de fármaco necesaria para inhibir el crecimiento in vivo y, con esto determinar el régimen de dosificación necesario para el paciente (Carroll et al., 2015). También se utiliza como criterio que define las cepas como resistentes, intermedias o susceptibles a un determinado medicamento. Una limitación de este criterio es que la CIM solo muestra que el crecimiento bacteriano se inhibe a determinada concentración del fármaco sin embargo, todavía pueden haber bacterias viables con habilidad de recuperarse cuando se elimina el medicamento (Carroll et al., 2015). Los agentes antibacterianos pueden clasificarse como bacteriostáticos o bactericidas. Los antibióticos bactericidas matan a las bacterias y los antibióticos bacteriostáticos suprimen el crecimiento de las bacterias y las mantienen en la fase estacionaria de crecimiento (Bernatová et al., 2013). Los agentes que son principalmente bacteriostáticos requieren concentraciones mínimas inhibitorias del fármaco mucho más bajas que las concentraciones requeridas de fármacos bactericidas (Lampidis y Maddix, 2017). 15 3.2.2. Neomicina Información Química La neomicina es una mezcla de antibióticos producto de la fermentación de Streptomyces fradii. Los principales componentes de la mezcla son los estereoisómeros neomicina B y C y el producto de degradación neomicina A, llamado también neamina (Figura 1). Las neomicinas B y C tienen una fórmula molecular de C23H46N6O13. (Lovering & Revees, 2011). La mezcla de neomicina es de carácter amorfo y se caracteriza por tener un grupo aminociclitol y aminosacáridos unidos al anillo de aminociclitol por medio de un enlace glicosídico. Los grupos amino contribuyen a la naturaleza básica de esta clase de antibióticos y los grupos hidroxilos de los azúcares contribuyen a una alta solubilidad en agua (O’Neil, 2013). El producto disponible comercialmente consiste casi en su totalidad en la sal de sulfato de la neomicina B. Dependiendo del contenido de neomicina C, la Farmacopea Europea distingue el sulfato de neomicina y el sulfato de framicetina. Los límites del contenido de neomicina C son de 3,0 a 15,0% para el sulfato de neomicina y menos de 3,0% para el sulfato de framicetina (Stypulkowska et al., 2013). El sulfato de neomicina B es un polvo higroscópico o sólido cremoso, inodoro o casi inodoro, de color blanco a ligeramente amarillo (Plumb, 2018). Su potencia antimicrobiana no es inferior a 680 unidades por mg, calculada con referencia a la sustancia seca. Es muy soluble en agua, ligeramente soluble en alcohol y prácticamente insoluble en acetona, cloroformo y éter. Una solución al 1% en agua tiene un pH de 5,0 a 7,5 (NCBI, 2019). Este producto requiere almacenamiento en recipientes herméticos y protección de la luz (Sweetman, 2009). 16 Figura 1: Estructura de la Neomicina. Tomado de O’neil, 2013. En el siguiente cuadro se presenta la información de solubilidad de la neomicina con respecto a algunos disolventes de interés. Tabla 1: Solubilidad de la Neomicina Información Fisicoquímica Solubilidad (mg/ml) a 28ºC Neomicina B HCl Neomicina Sulfato Agua 15,0 6,3 Metanol 5,7 0,225 Etanol 0,65 0,095 Isopropanol 0,05 0,082 Elaboración propia. Fuente O’Neil, 2013. Con respecto a la estabilidad, se ha reportado que el polvo de framicetina mantiene su potencia antimicrobiana, luego de 24 meses de almacenamiento. El polvo de la sal sulfatada es estable por lo menos 3 años a una temperatura de 20͒C. El sulfato de neomicina puede ser calentado a 110͒C por 10 horas, como en el caso 17 de una esterilización por calor seco sin sufrir pérdida de potencia, aunque puede adquirir una tonalidad amarillenta (Heyes, 1979). Las soluciones acuosas de neomicina B son estables en rangos de pH de 2 a 9 a temperatura ambiente. Esto cambia a temperaturas de 45ºC, donde se ha descrito una pérdida de potencia hasta un 94% durante un periodo de 2 años en soluciones con un rango de pH de 4 a 8. La neomicina es estable a la acción de las bases, pero no de los ácidos. La presencia de glicerina, propilenglicol y manitol a concentraciones entre 1 y 10% mejora la apariencia de las soluciones previniendo la decoloración. Los polioles o polialcoholes también previenen las variaciones en el pH (Heyes, 1979; O’Neil, 2013). Relacionado con la estabilidad de la neomicina en formulaciones farmacéuticas, cabe de destacar la pérdida de potencia reportada en una suspensión con goma tragacanto y azúcares, que mostró estabilidad por 10 días a 4ºC, pero se observó una pérdida de potencia al exponerse a la luz solar. Otros compuestos con los que se han reportado problemas de estabilidad son lanolina hidratada y polietilenglicol (Heyes, 1979). La neomicina sufre degradación al ser sometida a una temperatura de 50ºC y una humedad relativa de 100% por más de 8 días y se da un cambio a un líquido café con olor fuerte que es corroborado por un cambio en el espectro de absorción ultravioleta del compuesto y la disminución de la actividad microbiológica (WHO, 1986). Mecanismo de Acción Los antibióticos aminoglucósidos son bactericidas a concentraciones altas, la magnitud de la destrucción bacteriana depende de la concentración del antibiótico. A concentraciones bajas, los aminoglucósidos son únicamente bacteriostáticos. La eficacia de los aminoglucósidos aumenta si las concentraciones máximas de fármaco en plasma o tejido superan la CIM en 10 a 12 veces. Se recomienda su uso en una dosis única al día para mejorar la eficacia y la seguridad (MacDougall, 2018). 18 El sitio de acción de los aminoglucósidos es el ribosoma, al cual se unen de forma irreversible, particularmente a la subunidad 30S, pero también a la subunidad 50S, por lo que interfieren con la síntesis de proteínas (MacDougall, 2018). Esto se ilustra de manera general en la Figura 2. Para llegar al ribosoma, los aminoglucósidos primero deben cruzar el recubrimiento de lipopolisacáridos (LPS, en organismos gramnegativos), la pared celular bacteriana y la membrana celular. Debido a la polaridad de estos compuestos, se requiere un proceso de transporte activo especializado (Boothe, 2018a). La primera etapa requiere la unión del aminoglucósido catiónico a los componentes aniónicos en la membrana celular. Estos son dependientes de energía e implican el transporte del aminoglucósido catiónico polar, altamente cargado, a través de la membrana citoplásmica. La fuerza motriz para esta transferencia es probablemente el potencial de membrana. Estos procesos son mucho más eficientes en ambientes aeróbicos (Boothe, 2018a). Los aminoglucósidos se asocian con un efecto postantibiótico en bacterias gramnegativas (E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa). El efecto generalmente dura entre 2 y 8 horas después de la exposición y permite intervalos de dosificación más largos (Boothe, 2018a). Las bacterias anaeróbicas, como por ejemplo Clostridium sp y Bacteroides sp, son generalmente resistentes, porque carecen de los sistemas de transporte apropiados. Además, en ambientes con oxígeno disminuido, como en los tejidos hipóxicos, la transferencia a las bacterias disminuye. Los cationes divalentes como el calcio y el magnesio pueden interferir con el transporte hacia las bacterias porque pueden competir por los sitios aniónicos específicos (Boothe, 2018a). El movimiento pasivo de los aminoglucósidos a través de las membranas celulares bacterianas se facilita mediante un pH alcalino. El pH ácido puede aumentar la resistencia. De igual forma los cambios en la osmolalidad también pueden alterar la captación de aminoglucósidos. El sinergismo es común cuando se usan en combinación con los antibióticos β-lactámicos (como penicilinas y 19 cefalosporinas). La lesión de la pared celular inducida por los compuestos β- lactámicos permite un fácil acceso a la membrana de la célula bacteriana (Boothe, 2018). Figura 2: Mecanismo de acción de los aminoglucósidos. Fuente: Trevor y colaboradores, 2015. Como se mencionó anteriormente, los aminoglucósidos dentro de la célula se unen a la subunidad ribosomal 30S e interfieren con la síntesis de proteínas al bloquear la formación del complejo de iniciación 30S-50S en el codón de inicio (AUG). Esto lleva a la acumulación de complejos de inicio anormales llamados monosomas que, al acumularse, bloquean la traducción adicional del ARNm (Katzung, 2018). También se provoca la lectura incorrecta del código del ARNm lo que lleva a la terminación prematura de la traducción con el desprendimiento del complejo ribosomal y la proteína, o la síntesis de proteínas de forma incompleta, por la incorporación de aminoácidos incorrectos, lo que resulta en la producción de 20 proteínas anormales o no funcionales. Además, pueden interferir al inhibir la translocación de proteínas. Las proteínas aberrantes resultantes pueden insertarse en la membrana celular, conduciendo a una permeabilidad alterada y a un mayor transporte de aminoglucósidos hacia las células (MacDougall, 2018). Indicaciones de Uso en Medicina Veterinaria Debido a que la neomicina es más nefrotóxica y menos eficaz que otros aminoglucósidos, su uso generalmente es: la aplicación tópica, formulaciones para los ojos y oídos, tratamiento oral de infecciones entéricas, reducción del número de microorganismos en el colon antes de una cirugía de colon, y administración oral o de enema para reducir las bacterias productoras de amoníaco en el tratamiento de la encefalopatía hepática (Plumb, 2018). Al no absorberse sistémicamente, luego de su administración produce un efecto local a nivel gastrointestinal. La neomicina se utiliza muchas veces en combinación con otros antibióticos para el tratamiento tópico de infecciones. También se utiliza vía oral para el tratamiento de infecciones como la colibacilosis (Papich, 2016). Espectro de Acción La neomicina tiene un mecanismo de acción y un espectro de actividad (principalmente contra aerobios gram negativos) similar a los otros aminoglucósidos, pero en comparación con la gentamicina o la amikacina, es significativamente menos eficaz contra varias cepas de Klebsiella sp, Escherichia coli y Pseudomonas sp. La mayoría de las cepas de bacterias de estas especies resistentes a la neomicina siguen siendo susceptibles a la amikacina (Plumb, 2018). 21 3.2.3. Sulfonamidas Anteriormente se había mencionado que la suspensión de antibióticos de interés contiene tres antibióticos de la familia de las sulfonamidas, que son sulfaguanidina, sulfadiazina y sulfamerazina. Con respecto a estos compuestos la sulfadiazina es la que cuenta con mayor documentación de su uso clínico tanto en humanos como en animales (Plumb, 2018; Papich, 2016). Información Química Las sulfonamidas son derivados de la sulfanilamida, aunque son anfóteras, generalmente se comportan como ácidos orgánicos débiles y son mucho más solubles en soluciones acuosas alcalinas que en soluciones ácidas. Algunos derivados de la sulfonamida, como la sulfaguanidina, son tan insolubles que no se absorben en el tracto gastrointestinal. En general as sulfonamidas presentan valores de pKa entre 4,8 y 8,6 (Boothe, 2018). Se ha utilizado clínicamente la mezcla de sulfonamidas, como el grupo sulfapirimidina (sulfametazina, sulfamerazina y sulfadiazina). En este caso, cada sulfonamida en una mezcla de sulfonamidas exhibe su propia solubilidad en solución (ley de solubilidad independiente); las sulfonamidas no afectan significativamente la solubilidad de las otras, pero el efecto antimicrobiano es aditivo; por lo tanto, el uso de "triple sulfas" (tres sulfonamidas formuladas en solución juntas) permite aumentar la eficacia sin un aumento significativo del riesgo de efectos adversos. Se obtiene un efecto antimicrobiano aditivo a una dosis total sin el potencial de generar cristaluria (Riviere y Papich, 2017; Craigmill et al., 2018). La sulfaguanidina es una molécula de estructura C7H10N4O2S es un polvo blanco o casi blanco fino y cristalino. Este compuesto puede encontrarse comercialmente en su forma monohidratada. Es muy poco soluble en agua, un gramo logra disolverse en un litro de agua a 25ºC (O’Neil, 2013). Es poco soluble en alcohol, presenta mayor solubilidad en acetona y logra disolverse en soluciones diluidas de ácidos minerales. Además, es insoluble en soluciones de NaOH a 22 temperatura ambiente. Este compuesto debe protegerse de la luz solar (Sweetman, 2009). Figura 3: Estructura de la sulfaguanidina. Tomado de O’neil, 2013. La sulfadiazina es un polvo cristalino o cristales inodoros o casi inodoros, de color blanco a ligeramente amarillo. La fórmula molecular corresponde a C10H10N4O2S. Es prácticamente insoluble en agua (1 en 13 000) y poco soluble en alcohol y acetona. La sulfadiazina se disuelve en soluciones de hidróxidos alcalinos como potasio, sodio y amonio; o de ácidos minerales diluidos. Esta sustancia es sensible a luz y debe ser almacenada en envases adecuados ya que puede adquirir una coloración oscura. Usualmente se utiliza la sulfadiazina en combinación con el trimetoprim. (Plumb, 2018; Sweetman, 2009). El punto de fusión de la sulfadiazina es entre 252 y 256ºC (O’Neil, 2013). Esta sustancia es anfotérica. Puede sufrir hidrólisis generando diversos productos como sulfanilamida y ácido sulfanílico (Klaus, 1982). La sal sódica es un polvo blanco, soluble 1 en 2 en agua formando soluciones alcalinas, y ligeramente soluble en alcohol, al exponerse a la humedad adsorbe dióxido de carbono liberando sulfadiazina y pierde su solubilidad en agua. Este compuesto debe ser almacenado en contenedores cerrados a una temperatura de 25ºC protegido de la luz. Las soluciones de esta sal son alcalinas, incompatibles con fármacos de carácter ácido y formulaciones inestables a pH alto (Sweetman, 2009). Con respecto a la estabilidad de la sal sódica, luego de 10 días de exponerse a 50ºC y condiciones de humedad relativa del 100%, el polvo blanco sufre degradación y se torna en una masa pastosa y amarillenta, a medida que aumenta el 23 tiempo de exposición la masa se torna cada vez más líquida (30 días). Esta degradación produce sulfadiazina por absorción de dióxido de carbono (WHO, 1986). Figura 4: Estructura de la sulfadiazina. Tomado de O’neil, 2013. La sulfamerazina tiene una fórmula molecular correspondiente a C11H12N4O2S y es un polvo blanco cristalino o cristales, ligeramente amarillento o rosado. Es muy poco soluble en agua y diclorometano, poco soluble en alcohol y acetona. El compuesto logra disolverse en soluciones de hidróxidos alcalinos o ácidos minerales diluidos. Al igual que las sulfas anteriores debe de protegerse de la luz, porque adquiere una coloración oscura. Esta sulfonamida también se encuentra en forma de sal sódica (Sweetman, 2009). La sal monosódica consiste en cristales con sabor amargo y cáustico, es higroscópica. Al exponerse a la humedad sufre degradación a sulfamerazina. Las soluciones acuosas, un gramo se disuelve en 3,6 ml, tienen carácter alcalino (O’Neil, 2013). El punto de fusión de la sulfamerazina es entre 234 y 238ºC lo que resulta en su descomposición (O’Neil, 2013; Bazzini & Wermuth, 2015). Figura 5: Estructura de la sulfamerazina. Tomado de O’neil, 2013. Las sulfonamidas pueden ser clasificadas por estructuras en sulfonamido- pirimidinas y sulfonamido-piridazinas. Estos dos grupos tienen estructuras y 24 constituyentes similares y su diferencia más significativa es la posición de los átomos de nitrógeno en el anillo heterocíclico. En una investigación de Sainz-Díaz y colaboradores (2018) se estudiaron las diferentes conformaciones de moléculas representativas de estos grupos. Las principales interacciones intermoleculares para el empaquetamiento de cristales encontradas para estas sulfonamidas son fuertes puentes de hidrógeno donde los átomos de oxígeno sulfóxido y los átomos heterocíclicos de nitrógeno son los aceptadores principales y los grupos amino son los principales donadores. Las interacciones π-π también son importantes entre los anillos aromáticos junto con interacciones electrostáticas adicionales entre algunos grupos funcionales. Todas estas interacciones intermoleculares son responsables del empaquetamiento de cristales en los polimorfos en las sulfonamidas. Las conformaciones y los empaquetamientos dentro de las estructuras cristalinas reportadas fueron muy similares entre las dos moléculas representativas (Sainz-Díaz et al., 2018). Los reportes anteriores de polimorfismo con respecto a sulfonamidas específicas no registraban formas polimórficas para la sulfadiazina ni la sulfamerazina. En un análisis realizado en 16 compuestos del grupo, se reportan 4 formas cristalinas para la sulfaguanidina y un solvato monohidratado (Yang y Guillory, 1972). Luego de la identificación en 1992 de dos formas polimórficas de la sulfamerazina fue posible la preparación en cantidades suficientes de la forma II para permitir su comparación y análisis respecto a la forma I. Los polimorfos son enantiómeros y presentan una temperatura de transición entre 51 y 54 °C, aunque este proceso tiene una cinética lenta. La forma I es estable a temperaturas más altas, mientras que el polimorfo II es estable a temperaturas más bajas. Los puntos de fusión del polimorfo I y II son 237°C y 212-214°C respectivamente (Park et al., 2015 & Zhang et al., 2002). Con respecto a la sulfadiazina se cree que presenta una forma cristalina identificada hasta el momento (Caron et al., 2013). En investigaciones realizadas se ha reportado que la sulfadiazina forma solvatos con facilidad con 25 solventes que tienen una fuerte capacidad de aceptores de puentes de hidrógeno (Zhang et al., 2018). Mecanismo de Acción Estructuralmente las sulfonamidas tienen un núcleo químico común que se parece al ácido p-aminobenzoico (PABA). La actividad antibacteriana de las sulfonamidas depende un grupo amino libre en la posición 4 y un grupo sulfonamida en la posición 1. Los anillos heterocíclicos o aromáticos que sustituyen a la sulfonamida mejoran esta actividad al modificar la absorción y la tolerancia gastrointestinal (van Bambeke et al., 2017). Las sulfonamidas pueden clasificarse de acción corta (sulfisoxazol), de acción intermedia (sulfametoxazol) y de acción prolongada (sulfadoxina). Las sulfonamidas son inhibidores bacteriostáticos de la síntesis de ácido fólico. Como antimetabolitos de PABA, son inhibidores competitivos de la dihidropteroato sintasa. También pueden actuar como sustratos para esta enzima, provocando la síntesis de formas no funcionales de ácido fólico (Katzung, 2018). El mecanismo de acción resulta en el bloqueo de varias enzimas necesarias para la biogénesis de las bases de purina y otras reacciones metabólicas necesarias para la formación de ácidos nucleicos como puede observarse en la Figura 6. Su eficacia antibacteriana depende del tiempo de exposición. La acción sinérgica con diaminopirimidinas hace que estos medicamentos sean mucho más efectivos que usados individualmente. El espectro de todas las sulfonamidas es generalmente el mismo, inhiben bacterias gran positivas y gran negativas, Nocardia, Actinomyces spp y algunos protozoarios como coccidios y Toxoplasma spp (Boothe, 2018b). 26 Figura 6: Mecanismo de acción de las sulfonamidas. Tomado de Katzung y colaboradores, 2019. Indicaciones de Uso en Medicina Veterinaria La sulfadiazina se utiliza como tratamiento único ocasionalmente, aunque su eficacia no está establecida para muchas infecciones. La mayoría de las veces se usa junto a trimetoprim para tratar infecciones de las vías urinarias e infecciones de la piel. También puede utilizarse con pirimetamina para el tratamiento de infecciones protozoarias (Papich, 2016). Las sulfonamidas en general son agentes bacteriostáticos mientras que la trimetoprim es bactericida, pero cuando se usan en combinación, las sulfonamidas potenciadas son bactericidas (Plumb, 2018). Las sulfonamidas generalmente se combinan con trimetoprim (TMP) o con ormetoprim en una proporción de 5:1 (sulfa:TMP), rara vez se usan solas en animales pequeños o caballos. No hay evidencia clínica de que una sulfonamida sea más o menos tóxica o eficaz que cualquier otra sulfonamida (Papich, 2016). 27 Espectro de Acción Las sulfas potenciadas tienen un espectro de actividad bastante amplio. Las bacterias grampositivas son generalmente susceptibles incluyendo la mayoría de los estreptococos, muchas cepas de estafilococos y Nocardia. Muchos organismos gramnegativos de la familia Enterobacteriaceae son susceptibles a las sulfas potenciadas, pero no a Pseudomonas aeruginosa. Algunos protozoos (Pneumocystis carinii, Coccidia y Toxoplasma) también son inhibidos por la combinación. Las sulfas potenciadas tienen poca actividad contra la mayoría de los anaerobios. La resistencia se desarrolla más lentamente con la combinación de fármacos que con cualquiera de los antibióticos utilizados por separado (Plumb, 2018). 3.2.4. Caolín y Pectina La suspensión de antibióticos de interés en esta investigación contiene además caolín y pectina, los cuales han sido utilizados como protectores gástricos, al igual que compuestos de bismuto, el carbón activado y sales de bario. Estos agentes se utilizan por su acción local dentro de la luz intestinal en la adsorción de bacterias y toxinas, además de proporcionar una capa protectora en las superficies inflamadas de la mucosa (Marks, 2013). Información Química El término caolín es el nombre que se le dá a un grupo de minerales arcillosos, pero también se usa para describir rocas arcillosas muy ricas en caolinita o haloisita. Es producido por la meteorización química de minerales de silicato de aluminio como feldespato en roca ígnea y metamórfica bajo la influencia de dióxido de carbono (Haldar y Tišljar, 2014). El caolín es un silicato de aluminio hidratado natural cuya fórmula estructural teórica corresponde a Al2Si2O5(OH)4 que se pulveriza y refina para uso farmacéutico. Es un polvo blanco, inodoro, casi insípido, untuoso, prácticamente insoluble en agua, en ácidos o hidróxidos alcalinos. El caolín se usa frecuentemente como agente de 28 suspensión y anti aglomerante en formulaciones farmacéuticas orales y tópicas (Awad et al., 2017). Es un material cristalino con una forma tricíclica que se encuentra en placas microscópicas pseudohexagonales, que se rompen con bastante facilidad. Su estructura se puede considerar como una capa de Al(OH)3, unida a una capa de siloxano Si2O5. La estructura puede tener sustitución isomorfa de los iones Si y Al por metales de transición o hierro. Esto conduce a cargas eléctricas en las placas y sitios ácidos en la superficie de las partículas de caolinita (Rothon, 2017). La caolinita reacciona solo con ácidos y bases muy fuertes, no se ve afectada por los disolventes orgánicos y sufre reacciones de intercambio iónico; pero se considera un mineral inerte. Sufre una serie de reacciones complejas cuando se calienta. Los productos comerciales se venden como caolín o arcilla china y el principal mineral presente suele ser la caolinita, la concentración e impurezas pueden variar (Rothon, 2017). El caolín natural puede estar contaminado con gran cantidad de microorganismos por lo que requiere esterilización (Sweetman, 2009). El caolín debe almacenarse en envases bien cerrados (USP 41, 2018). La pectina es un polímero de carbohidratos que consiste principalmente en ácidos poligalacturónicos parcialmente metoxilados como parte de la pared celular de tejidos vegetales. Ocurre naturalmente como el éster metílico parcial de las secuencias D-poligalacturonato unidas en α- (1 → 4) interrumpidas con residuos de (1→2) -L-ramnosa (O´Neil et al., 2013). Además, es un polvo fino, blanco o amarillento, casi inodoro, con un sabor mucilaginoso. Se obtiene de la extracción con ácido diluido de la cáscara interna de los cítricos o de la pulpa de manzana. Una de las fuentes masa abundantes es la cáscara de limón o naranja que contiene cerca de un 30% de este polisacárido. Un gramo de pectina es soluble en 20 ml de agua y forma una solución coloidal viscosa, opalescente y de fácil flujo (Plumb, 2018). 29 La pectina está compuesta de partículas cargadas negativamente e hidratadas con carácter ácido. Puede formar azúcares neutros cuando azúcares como D- galactosa, L-arabinosa, D-xilosa y L-fucosa forman cadenas laterales en la molécula de pectina. Es insoluble en alcohol y en otros solventes orgánicos. Las soluciones son estables bajo condiciones levemente ácidas, la exposición a ácidos o bases fuertes puede provocar despolimerización (O´Neil et al., 2013). Las diversas propiedades estructurales y macromoleculares de las pectinas, como la metoxilación de galacturonano, el contenido de ácido galacturónico, la composición de los azúcares neutros y el peso molecular, dependen de la fuente de pectina (Dranca & Oroian, 2018). La pectina se utiliza como agente emulsificante y estabilizante, es un agente adsorbente y formador de volumen. Estas características pueden afectar el tiempo de tránsito intestinal y afectar la absorción de otros fármacos (Sweetman, 2009). La pectina debe conservarse en envases impermeables (USP 41, 2018). Mecanismo de Acción Se cree que la combinación de caolín y pectina actúa como demulcente y adsorbente en el tratamiento de la diarrea. Esta acción puede estar relacionada con la unión a toxinas bacterianas en el tracto gastrointestinal. Sin embargo, los estudios clínicos no han demostrado ningún beneficio de su administración. Las investigaciones realizadas concluyen que estos agentes pueden cambiar la consistencia de las heces, pero no son efectivos al disminuir la pérdida de líquidos o electrolitos, ni reduce la sintomatología (Dowling, 2018). En relación con el caolín se cree que tiene un potencial de inhibición bacteriana. El mecanismo puede estar relacionada con la transferencia de elementos como hierro, cobre, plomo, fósforo o vanadio que son tóxicos para las células bacterianas, además de cambios en el pH y en el estado de oxidación. La caolinita tiene la capacidad de generar cationes divalentes que se pueden transferir fácilmente desde la superficie de la arcilla a la membrana celular bacteriana (Awad et al., 2017). 30 Al llegar allí son oxidados y se da la precipitación de óxidos de Fe3+ y Cu3+, estos a su vez generan radicales de hidroxilo letales que se adhieren y dañan biomoléculas presentes en las células bacterianas. Por su parte el catión Al3+ y otros cationes tri- o tetravalentes podrían precipitar en la pared celular bacteriana, inhibiendo la entrada de nutrientes o el flujo de residuos, provocando daño irreversible en los microorganismos (Awad et al., 2017). Indicaciones de Uso en Medicina Veterinaria La combinación caolín-pectina se usa principalmente en medicina veterinaria como agente antidiarreico oral. También se ha utilizado como agente adsorbente en casos de intoxicación (Plumb, 2018). El uso como adyuvantes se recomienda en casos de diarrea leve (Cooper, 2011). Espectro de Acción La combinación caolín-pectina es un agente inespecífico a nivel antibacteriano. Con respecto al potencial de adsorción de toxinas bacterianas, las investigaciones realizadas con enterotoxinas de E. coli han demostrado que estos agentes son inefectivos (Papich, 2016). 3.3. Suspensiones Los componentes principales del producto a reformular se analizaron en las secciones anteriores. Con respecto a los antibióticos utilizados la neomicina es soluble en agua, pero no así las sulfonamidas, que son compuestos con poca solubilidad en agua (Boothe, 2018b). Los excipientes como caolín y pectina también afectan las características de la forma farmacéutica. El primero es insoluble en agua, mientras que la pectina confiere viscosidad al vehículo al encontrarse disuelta. Todos estos aspectos deben ser tomados en cuenta para analizar el delicado equilibrio que se debe obtener para entender los problemas de estabilidad del producto y con esta información mejorar las características fisicoquímicas de la suspensión. 31 A continuación, se describirán las generalidades de las suspensiones y los diferentes factores que influyen en su formulación y estabilidad, además de los conceptos fisicoquímicos aplicados al estudio de estas formas farmacéuticas. 3.3.1. Generalidades Las suspensiones son sistemas en donde las partículas, generalmente de un sólido prácticamente insoluble y finamente dividido, están dispersas en un medio, el cual generalmente es un líquido. Las suspensiones orales generalmente tienen una alta viscosidad y grandes cantidades de un sólido dispersado. Por otra parte, una suspensión parenteral generalmente tiene una viscosidad baja y contiene menos de 5% de partículas sólidas (Kulshreshtha et al., 2010). Uno de los aspectos más importantes con respecto a las suspensiones es el tamaño de partícula del fármaco, en formulaciones farmacéuticas el diámetro puede rondar entre 1 y 50 μm (Crowley, 2005). Las suspensiones pueden dividirse en dos categorías principales según el tamaño de partícula: coloidales, con rango del diámetro de partícula aproximado de 0,1 a 1000 nm (1 μm), y gruesas, que tienen partículas más grandes (1 a 200 μm). Esto es de relevancia debido que la distribución de tamaño afecta las interacciones del sistema y las fuerzas que rigen estas interacciones (Mobley, 2013). Las razones para formular un producto farmacéutico en forma de una suspensión pueden incluir la poca solubilidad del fármaco en el vehículo, enmascarar algún sabor amargo, aumentar la estabilidad del fármaco al evitar su degradación por hidrólisis, oxidación o por actividad microbiológica, o promover una liberación controlada o sostenida de los compuestos activos del medicamento (Nash, 2013). La formulación de suspensiones está sometida a varios aspectos, como los relacionados a las partículas sólidas insolubles, la aptitud del medio dispersante para mantener estas partículas en suspensión y la facilidad con la que se puede revertir el estado suspendido cuando es alterado (Kulshreshtha et al., 2010). 32 3.3.2. Conceptos Físico Químicos Relevantes Propiedades Interfaciales y Superficiales. Las propiedades interfaciales y superficiales corresponden al estudio de las propiedades termodinámicas entre fases idealmente bien establecidas. El plano que marca idealmente el límite entre dos fases se denomina interfase, el plano que marca el límite entre la fase y el entorno a menudo se denomina superficie de la fase. Los fenómenos interfaciales estudiados incluyen temas como la adsorción, las energías interfaciales, la tensión interfacial, la carga superficial, y las relaciones entre ellas (Láng, 2015). La energía libre de superficie es un fenómeno físico causado por las interacciones intermoleculares en una interfase, como las fuerzas de dispersión de Londres, la fuerza inductiva de Debye, las fuerzas de orientación de Keesom, los enlaces de hidrógeno y las interacciones ácido-base de Lewis. (Park & Seo, 2011). Entre mayor es la energía superficial menos termodinámicamente estable es la suspensión resultante. Por lo tanto, entre más pequeñas son las partículas, más inestable será el sistema y este tiende a formar conglomerados para lograr mayor estabilidad. En el caso de la formación de suspensiones, el uso de agentes humectantes puede reducir la energía superficial. Estos compuestos logran esta reducción al adsorberse en la interfase. La ecuación que explica este fenómeno es: ∆ = ∆ (1) Donde ∆ es el cambio en la energía libre de superficie, ∆ es el cambio en el área superficial, γ representa la tensión interfacial entre las partículas del sólido y el medio dispersante (Kulshreshtha et al., 2010; Tadros, 2014). Doble Capa Eléctrica La doble capa eléctrica es la capa que rodea una partícula de la fase dispersa, incluyendo los iones adsorbidos en la superficie de la partícula y una película o capa del medio de dispersión de carga contraria. La doble capa eléctrica es eléctricamente 33 neutra y está compuesta de 3 partes: una superficie cargada, una capa profunda o capa de Stern de contraiones y una capa difusa con iones libres del disolvente (Park y Seo, 2011). Esto puede observarse en la Figura 7. Cuando las partículas dispersas están en contacto con una solución acuosa que contiene electrolitos, las partículas pueden adsorber selectivamente una carga conferida por estos iones. Los iones que dan a la partícula su carga, se denominan iones o co-iones determinantes del potencial. Las especies iónicas que quedan en la solución, que en su mayoría serían de una carga opuesta a la de los iones determinantes del potencial se conocen como contraiones. Estos se ven atraídos a la superficie cargada por fuerzas eléctricas opuestas y evitan la unión de cualquier carga adicional a la superficie de la partícula, una vez que se completa la adsorción inicial. Estas fuerzas eléctricas mantienen una distribución equitativa de todos los iones en solución (Dukhin & Goetz, 2017). La parte del medio dispersante que rodea inmediatamente a las partículas estará formada por los contraiones. Esta parte del medio, junto con estos contraiones, que está estrechamente unida a la superficie de la partícula, se conoce como la capa de Stern (Tadros, 2013). Alrededor de la capa de Stern se encuentra la capa difusa que contiene más contraiones que co-iones. La neutralidad eléctrica se obtiene dónde termina la capa difusa móvil. Más allá de la capa difusa, las concentraciones de co-iones y contraiones son iguales y las condiciones de neutralidad eléctrica prevalecen en la parte restante del medio de dispersión (Tadros, 2013). El grosor de la doble capa depende del tipo y concentración de iones en solución (Aulton, 2004). Dos conceptos que están relacionados con la doble capa eléctrica es el potencial de Nernst y el potencial Zeta. El potencial de Nernst es la diferencia del potencial eléctrico entre un punto de la superficie de una partícula y la región electroneutral. También se llama potencial de superficie o electro-termodinámico (Kulshreshtha et al., 2010). 34 Figura 7 Representación de la doble capa eléctrica. Tomado de Vaziri Hassas, 2013. Por su parte el potencial Zeta (ξ) se refiere a la diferencia de potencial entre el plano de desplazamiento que corresponde a los límites de la capa de Stern y la región electro-neutral. También se le llama potencial electrocinético y tiene gran efecto en la formulación de suspensiones estables. El potencial Zeta explica la repulsión entre partículas sólidas dispersas adyacentes de una misma carga. Si se logra reducir el potencial Zeta hasta cierto valor, las fuerzas atractivas de Van der Waals superan a las fuerzas de repulsión y las partículas pueden juntarse y formar flóculos. La magnitud del potencial depende de la carga y del grosor de la doble capa eléctrica (Giupponi y Pagonabarraga, 2011). Teoría DLVO La teoría DLVO explica el resultado de la interacción de partículas como coloides liófobos (coloides con poca atracción entre la fase dispersa y el medio dispersante). Sin embargo, también se puede aplicar a los sistemas de suspensión 35 grosera (Dukhin y Goetz, 2017). La colisión de partículas en una suspensión puede ocurrir debido al movimiento browniano o a las tasas de sedimentación diferencial. El resultado de esta colisión depende de las fuerzas atractivas o repulsivas entre las partículas (Kulshreshtha et al., 2010). La teoría de DLVO se expresa con la siguiente ecuación: = + (2) Donde VT es la energía potencial de interacción entre partículas, VR se refiere a la repulsión debido a la doble capa eléctrica y VA se refiere a la atracción producto de las fuerzas de Van der Waals. VR depende de otros factores como el radio de las partículas, la distancia entre ellas y la constante dieléctrica del medio, mientras que VA se ve afectado por el radio y la distancia interparticular. Esta teoría también puede ser explicada de manera gráfica (Figura 8), donde la h representa la distancia entre partículas (Kulshreshtha et al., 2010). En esta misma figura se pueden observar diferentes situaciones respecto a la colisión de partículas. Cuando el valor de VR es mucho mayor que VA como se muestra en la curva A (VR >> VA), la dispersión será altamente estable debido a la alta fuerza de repulsión neta. Esta dispersión será resistente a la agregación (floculación o coagulación) siempre que las partículas no sedimenten por efecto de la gravedad (Kulshreshtha et al., 2010). En ciertos casos, para aglomerarse, dos partículas en curso de colisión deben tener suficiente energía para superar el valor máximo (VM) de repulsión. A medida que las partículas superan la repulsión, se aglomeran debido a la fuerza de atracción y se mantiene en este estado debido a la fuerza de van der Waals-London. Si VM excede en gran medida la energía térmica media de las partículas, estas partículas no entrarán en P, el mínimo de energía primaria. El punto P del gráfico representa una distancia interparticular muy pequeña. El valor mínimo de VM que puede crear esta situación corresponde a un potencial zeta mayor a 50 mV. La gran magnitud de energía en este punto hace que las partículas se unan fuertemente entre sí, por lo 36 que es posible que en este punto se dé la compactación del sedimento en un "cake" duro, que será muy difícil de redispersar (Kulshreshtha et al., 2010). El punto S representa un mínimo secundario de la curva B donde se pueden crear agregados sueltos que generalmente se pueden resuspender o romper fácilmente por agitación o dilución. La floculación se produce en el mínimo de energía secundaria (el punto S) y la coagulación se produce en el mínimo de energía primaria o punto P. Cuando las fuerzas atractivas predominan sobre las fuerzas de repulsión (VA >> VR) todo el tiempo se producirá una rápida agregación (curva C) (Kulshreshtha et al., 2010). La agregación o el aumento de tamaño de las partículas sólidas se da mediante dos procesos: la coagulación, que consiste en la reducción de la repulsión electrostática entre partículas y la floculación mediante la unión de partículas por medio de agentes poliméricos (Concha A, 2014). Figura 8: Representación de la Teoría DLVO Tomado de Kulshreshtha, 2010. 37 La estabilidad de una suspensión se ve afectada por estabilización eléctrica y estabilización estérica. Las sustancias como los tensioactivos no iónicos, cuando se adsorben en la superficie de la partícula, pueden estabilizar estéricamente una suspensión, incluso cuando no hay un potencial zeta significativo. El término VS se refiere a esta estabilización estérica. Al agregar el término VS a la ecuación DVLO resulta en: = + + (3) 3.3.3. Formulación de una Suspensión Humectación El término humectación se refiere al desplazamiento de aire en una superficie sólida. Los ángulos de contacto de equilibrio entre líquidos y sustratos sólidos están determinados por la interacción entre estas dos fases. La baja adhesión entre la fase líquida y la superficie de los sólidos genera un ángulo de contacto muy grande. En una suspensión se requiere la humectación de las partículas sólidas con el fin de que estas tengan la habilidad de dispersarse adecuadamente en el medio líquido (Starov, 2013). El uso de agentes tensioactivos puede disminuir la tensión interfacial y generar una buena humectación. Las moléculas de estos agentes son anfifílicas o anfipáticas, ya que su estructura tiene una cabeza hidrófila (iónica o no iónica) con una afinidad por el agua y una cola hidrófoba (un grupo hidrocarburo) que es repelida por la fase acuosa. La cadena de hidrocarburos de los agentes tensioactivos se adsorbe sobre la superficie hidrofóbica de las partículas y el extremo polar permanece en contacto con el medio líquido (Kulshreshtha et al., 2010). Los tensioactivos con valores de HLB (equilibrio hidrófilo lipófilo por sus siglas en inglés) entre 7 y 9 pueden ser utilizados como agentes humectantes en concentraciones usuales menores a 0,1%. Algunos ejemplos son los polisorbatos y ésteres de sorbitano. Sin embargo, un exceso de tensioactivo puede producir espuma o la formación de sistemas defloculados (Aulton & Taylor, 2017). 38 Algunos polímeros hidrofílicos también pueden usarse como agentes humectantes, como es el caso de la goma acacia, la goma tragacanto, la goma Xantán, bentonita, silicato de aluminio y magnesio, sílice coloidal y algunos derivados celulósicos. Estos polímeros actúan formando una capa hidrofílica en la superficie de los sólidos, mejorando la humectación, pero si son utilizados en cantidades muy altas se puede provocar la gelificación de la suspensión (Tadros, 2013). La humectación también puede mejorarse con el uso de disolventes higroscópicos como alcohol, glicerina o propilenglicol, que son llamados agentes de levigación. Estos actúan disminuyendo la tensión líquido-aire, facilitando la penetración del disolvente entre las partículas del sólido y el desplazamiento del aire contenido en su superficie (Tadros, 2013). Sistemas floculados y defloculados La floculación de un sistema puede caracterizarse por la sedimentación observada. El volumen de sedimentación F, es la relación entre el volumen de equilibrio del sedimento, Vu y el volumen total de la suspensión, Vo como se puede observar en la siguiente ecuación: = (4) El valor de F varía de 0 a 1. En el caso de una suspensión defloculada, F tiene un valor relativamente pequeño, alrededor de 0,2. La suspensión con valores de F de 1 representa el sistema ideal, en equilibrio de floculación (Kulshreshtha et al., 2010). El equilibrio se obtiene cuando la suspensión está floculada, pero no hay sedimentación o formación de "cake". Este sistema también es estéticamente elegante ya que no presenta un sobrenadante visible. Los sistemas con valores de F mayores a 1, tienen un volumen final del sedimento mayor que el volumen original de la suspensión. Las partículas en la suspensión crean una red de flóculos tan sueltos que sobresalen del medio de dispersión, por lo que debe agregarse vehículo extra para cubrir el sedimento formado. El análisis del volumen de sedimentación aporta 39 una idea cualitativa sobre la sedimentación de una suspensión (Kulshreshtha et al., 2010). Los sistemas floculados y defloculados se pueden diferenciar con respecto a las modificaciones que sufren al pasar el tiempo desde su fabricación. Un sistema defloculado casi no muestra cambios en la apariencia después de unos pocos minutos de fabricación. Después de varias horas, la suspensión aún sigue turbia, pero comienza a aparecer un sedimento compacto y pequeño. Después de un almacenamiento prolongado, se obtiene un sobrenadante claro junto con un sedimento compacto (Nash, 2013). En un sistema floculado más bien, a pocos minutos de fabricación se evidencia un sobrenadante encima del sedimento. Después de varias horas, aumenta el volumen de sobrenadante, y en este punto, el tamaño del sedimento es mayor que el encontrado en el sistema defloculado. Después de un almacenamiento prolongado el volumen del sedimento mostrará pocos cambios (Nash, 2013). La formación de una suspensión floculada consiste en la agregación menos rígida o suelta de las partículas, que se mantienen unidas mediante enlaces partícula-partícula relativamente débiles. Estos agregados son más grandes y pesados que las partículas individuales, por lo que se asientan más rápido que las partículas defloculadas. El sedimento se forma bastante rápido, se empaqueta de manera suelta y forma un volumen grande de sedimento que se resuspende fácilmente. La sedimentación produce un líquido sobrenadante que permanece claro, ya que las partículas quedan atrapadas dentro de la estructura y se asientan juntas (Bruschi, 2015; Gregory, 2013). Con respecto a las características electrostáticas, un sistema defloculado tiene un potencial zeta mayor que el valor crítico en el momento en que las fuerzas repulsivas sobrepasan a las fuerzas atractivas. Cuando existe una fuerte atracción entre las partículas, es probable que las partículas en los agregados se adhieran al primer contacto, con pocas posibilidades de reorganización, formando flóculos sueltos. Por el contrario, cuando solo hay una atracción débil o una ligera repulsión 40 (como en las suspensiones defloculadas), pueden ser necesarias varias colisiones antes de que se produzca la unión de las partículas o agregados, lo que lleva a estructuras más compactas. Por esto las partículas de un sistema defloculado permanecen suspendidas por más tiempo, y solo una pequeña parte del sólido se sedimenta debido a la gravedad (Gregory, 2013). Cuando finalmente se genera la sedimentación, las partículas más pequeñas se acoplan dentro de las más grandes y las partículas en el fondo del sedimento están presionadas por el peso de las partículas que están más arriba. Esto aumenta la cercanía de las partículas y la interacción por medio de las fuerzas de Van der Waals-London. Como resultado, se forma un sedimento compacto que es difícil o imposible de redispersar. Estas partículas pequeñas dan el aspecto turbio a las suspensiones defloculadas debido a los sólidos finos dispersos en el medio (Gregory, 2013). La floculación puede ser provocada por agentes como tensioactivos no iónicos y polímeros. De igual forma agregar una pequeña cantidad de electrolito, el potencial zeta del sistema se reduce. Cuando se encuentra por debajo del valor crítico, las fuerzas atractivas son mayores que las fuerzas repulsivas, y se produce la formación de agregados (Nash, 2013). Los sistemas defloculados por su lenta velocidad de sedimentación permiten una dosificación uniforme, en las suspensiones floculadas, por el contrario, las partículas se sedimentan rápidamente, lo que podría provocar una dosificación inexacta. La creación de una condición intermedia conocida como floculación controlada es posible y deseable, donde se obtienen las mejores características de ambos sistemas en una suspensión (Nash, 2013). Floculación Controlada Una suspensión parcialmente floculada, con suficiente viscosidad, tendrá propiedades de sedimentación deseables. La floculación controlada se puede lograr 41 mediante una combinación del control en el tamaño de partícula y el uso de agentes floculantes (Aulton & Taylor, 2017). La formulación de un sistema de floculación controlada o estable se puede apreciar en la Figura 9 (Nash, 2013). El estado floculado representado en C, se puede alcanzar directamente humedeciendo y dispersando partículas hidrófobas (A) con un tensioactivo floculante adecuado, o indirectamente humedeciendo y dispersando para producir una partícula defloculada (B) con un tensioactivo adecuado y luego floculando con un agente adecuado tal como un coloide hidrófilo o un electrolito. La sobre-floculación severa, causada por la adición de un exceso de agente floculante o por una exposición prolongada a condiciones térmicas extremas tiende a producir sistemas irreversiblemente aglomerados o coagulados (E). En ausencia de un coloide protector, se genera el proceso de crecimiento de cristales como se indica mediante la flecha que conecta los estados A con D (Nash, 2013). Figura 9: Fenómenos de floculación y defloculación en la formulación de una suspensión con floculación controlada. Tomado de Nash, 2013. 42 Con el fin de lograr una floculación controlada se utilizan una serie de agentes y estrategias de procesamiento que cumplen diferentes funciones en la estabilización del sistema en dispersión. Entre éstos los más utilizados son los electrolitos, los tensioactivos, los hidrocoloides, los métodos de reducción del tamaño de partícula, el control del crecimiento de cristales y la optimización del vehículo (Swarbrick et al., 2006). Los electrolitos actúan reduciendo el potencial zeta, dando lugar a la unión de las partículas en estructuras laxas. El poder floculante de los iones aumenta con su valencia. Por lo tanto, los iones de calcio son más potentes que los iones de sodio o potasio. Según esta idea el uso de iones trivalentes sería lo más adecuado. Sin embargo, se usan con menos frecuencia debido a su toxicidad. Cuando se agregan electrolitos a una suspensión defloculada cargada positivamente, el potencial zeta disminuye lentamente. El volumen de sedimentación llega a su máximo en valores de potenciales cercanos a cero (Aulton y Taylor, 2017). Se pueden usar tensioactivos iónicos y no iónicos como agentes floculantes. Los tensioactivos iónicos causan floculación al neutralizar la carga en las partículas. Debido a su estructura larga, los tensioactivos no iónicos se adsorben sobre más de una partícula, formando así una estructura floculada laxa (Aulton & Taylor, 2017). Los polímeros de cadena lineal y ramificada forman una red similar a un gel que se adsorbe sobre la superficie de partículas dispersas, manteniéndolas en estado floculado. Los polímeros hidrofílicos también pueden funcionar como coloides protectores impidiendo que los flóculos se adhieran estéricamente entre sí. A bajas concentraciones de polímero, cuando las partículas del fármaco no están completamente cubiertas por los polímeros, se forman puentes entre múltiples partículas y se favorece la floculación (Kulshreshtha et al., 2010). Los polielectrolitos son polímeros con grupos ionizables, los cuales se disocian en polímeros cargados de iones pequeños de carga opuesta al entrar en contacto con disolventes polares. Estos polímeros son capaces de actuar electrostática y estéricamente. Los polímeros lineales como la carboximetilcelulosa 43 sódica funcionan mejor como agentes floculantes; sin embargo, los polímeros enrollados como la polivinilpirrolidona no conducen a la floculación sino que mejoran la estabilidad estérica (Kulshreshtha et al., 2010). Con respecto al tamaño, las partículas más pequeñas pueden tener un mayor efecto en el aumento de la viscosidad del sistema porque tienen un área de superficie mayor que las partículas más grandes. Con respecto a la biodisponibilidad, el uso de partículas más pequeñas puede proporcionar una mejor absorción del fármaco debido a su mayor área de superficial. Las partículas más pequeñas también son más adecuadas para lograr la uniformidad en la dosis. La mayoría de las suspensiones farmacéuticas contienen sólidos polidispersos y es deseable que la distribución de tamaño sea estrecha para asegurar una sedimentación uniforme y que además permita la repetibilidad de las características de la suspensión lote a lote (Swarbrick et al., 2006). La maduración de Ostwald o el crecimiento de cristales, es un fenómeno que tiene efectos en la sedimentación, la estabilidad física, redispersabilidad, aspecto y biodisponibilidad de las suspensiones. Como se mencionó anteriormente en una suspensión hay un rango de tamaño de partícula, siendo las partículas más pequeñas más solubles en el medio de dispersión. Al aumentar la temperatura, más partículas pequeñas se disuelven y reducen más su tamaño. Al bajar la temperatura, el fármaco disuelto tiende a recristalizar en la superficie de las partículas existentes. Una ligera fluctuación de la temperatura puede hacer que la distribución en el tamaño de partícula cambie hacia tamaños de partícula más grandes. Este problema puede eliminarse inicialmente utilizando un rango de tamaño de partícula estrecho (Tadros, 2013). Los agentes tensioactivos o coloides poliméricos pueden prevenir el crecimiento de cristales al ser adsorbidos en la superficie de la partícula. Cuanto menor sea la capacidad de solubilización del tensioactivo, más eficiente será en la prevención del crecimiento de cristales. El crecimiento de cristales también puede ocurrir con fármacos polimórficos, siendo la forma metaestable la más soluble. A 44 medida que la forma metaestable cambia a una forma más estable, se favorece la cristalización (Aulton y Taylor, 2017). Sedimentación La tasa de sedimentación de partículas se puede determinar por la ley de Stokes. Esta ecuación explica una condición ideal en la que las partículas sólidas perfectamente esféricas están en una suspensión muy diluida y se asientan sin turbulencia, sin chocar con otras partículas y sin atracción o afinidad química o física por el medio de dispersión. La ecuación incluye diferentes parámetros: V como la velocidad terminal de la sedimentación en cm/s, d es el diámetro de la partícula en cm, ρ1 y ρ2 son las densidades de las partículas suspendidas y el medio respectivamente, g es la aceleración de la gravedad, y ŋ0 es la viscosidad del medio (Kulshreshtha et al., 2010). = (5) En relación con la ley de Stokes se infiere que las partículas más pequeñas producen una sedimentación lenta; de ser excesivamente lenta en una suspensión defloculada puede provocar la formación de sedimentos compactos. Esta ley puede usarse para mejorar una suspensión mediante el análisis de cada uno de sus componentes. Por ejemplo, la viscosidad del medio se puede aumentar para reducir la tasa de sedimentación. La diferencia de densidad entre la fase dispersa y el medio de dispersión es otro parámetro importante; una diferencia de cero significaría que no hay sedimentación. Aunque, la densidad de la fase dispersa no se puede cambiar, se puede aumentar la densidad del medio usando excipientes como sorbitol líquido, glicerina o propilenglicol. Estos agentes, además de reducir la diferencia de densidades, también pueden ser usados para aumentar la viscosidad del medio (Aulton y Taylor, 2017). La ley de Stokes es válida para suspensiones farmacéuticas diluidas compuestas por no más de 2% de sólidos. Esta situación puede no ser aplicable a muchas formulaciones farmacéuticas. En una suspensión diluida, las partículas 45 sólidas sedimentan sin interferir entre sí. Por el contrario, en una suspensión concentrada estas interferencias pueden ocurrir y afectar los procesos de sedimentación. Además, una alta concentración de sólidos aumenta la viscosidad del sistema, afectando la velocidad de sedimentación. Otro aspecto importante es que la aplicación de la ecuación supone que las partículas son esféricas y monodispersas, lo cual es difícil de encontrar en sistemas reales (Siepmann et al., 2010). La ley de Stokes no es aplicable completamente a los sistemas de suspensiones farmacéuticas comunes. La utilidad de la ley de Stokes radica en los conceptos básicos que se describen por medio de la ecuación analizada. Estos parámetros son indicativos de factores importantes que controlan de manera general los procesos de sedimentación de las partículas y por lo tanto sirven como guía para realizar posibles ajustes en el proceso de formulación de una suspensión (Siepmann et al., 2010). Características reológicas deseadas La reología es una rama de la física que estudia el flujo o la deformación de los fluidos frente a la aplicación de una fuerza. Las características reológicas de una forma de dosificación farmacéutica tienen impacto sobre su formulación, proceso de fabricación, control de calidad y en la estabilidad de la formulación. Dependiendo de la naturaleza y la concentración de las partículas dispersas, las suspensiones pueden exhibir flujo newtoniano o flujo no newtoniano, el cual se clasifica a su vez en flujo plástico, flujo pseudoplástico o flujo dilatante (Acharya et al., 2018). La reología es importante en la estabilidad de las suspensiones farmacéuticas porque la viscosidad, según lo establecido por la ley de Stokes, puede modificar la velocidad de sedimentación. Mantener la viscosidad adecuada de las suspensiones es importante para garantizar la precisión de la dosificación y la facilidad de vertido de la suspensión. La reología también puede afectar el proceso de fabricación de suspensiones. Una mezcla altamente viscosa produce una fricción excesiva en la maquinaria de mezcla, lo que resulta en un gasto innecesario de energía (Aulton & Taylor, 2017). 46 Las suspensiones floculadas concentradas tienen una alta viscosidad cuando están estáticas, debido a la alta atracción interparticular. Al agitar el sistema, la viscosidad disminuye sustancialmente cuando se alcanza la fuerza mínima necesaria para superar esa atracción. Estas características son típicas de un fluido plástico, en el cual se observa un umbral de fluidez. En el caso de un fluido pseudoplástico, la viscosidad inicial es elevada bajo agitación reducida, aunque no presenta un umbral de fluidez. A medida que aumenta la fuerza aportada por la agitación la viscosidad disminuye. Los sistemas plásticos y pseudoplásticos pueden ser usados para formular suspensiones estables ya que, ante una fuerza como la agitación del recipiente que los contiene, se vuelven menos viscosos y se facilita la extracción y dosificación (Tadros, 2011). Cuando cesa la fuerza aplicada, la viscosidad del sistema aumenta y vuelve al valor original. En el caso de fluidos pseudoplásticos con tixotropía, la recuperación del sistema hasta volver al estado inicial no es inmediato, lo cual representa una ventaja, dado que en reposo la viscosidad del producto será lo suficientemente alta para mantener las partículas suspendidas durante la vida útil. Pero cuando se somete el producto a agitación, se disminuirá la viscosidad y se mantendrá así durante un período de tiempo suficiente para permitir el retiro preciso de la dosis (Kulshreshtha et al., 2010). En el flujo tixotrópico el aumento de la velocidad de cizalla por efecto de la agitación disminuye la viscosidad, provocado por la ruptura física en la estructura del material. Cuando se permite que el material quede en reposo, la estructura de red de gel puede reformarse, causando que la viscosidad aumente nuevamente. El reformar la estructura lleva tiempo porque requiere de difusión a nivel molecular o la migración de partículas por efecto de pequeñas fuerzas, lo que lleva a la disminución de la energía termodinámica (Darvell, 2018). Los rasgos característicos de los materiales tixotrópicos son el punto de elasticidad o el punto inicial de deformación, la disminución de la viscosidad con el aumento de la velocidad de deformación y la incapacidad de volver por el mismo 47 camino cuando la velocidad de deformación por cizallamiento disminuye. En la figura 10 se puede observar que al aumentar constantemente la velocidad de cizalla (la deformación), la viscosidad (tangente) cae constantemente, pero al invertir la dirección de cambio de la velocidad de esfuerzo de cizalla, no se da por la trayectoria original (Darvell, 2018). Esto significa una deformación en la estructura del sistema que no se reforma inmediatamente al suspender o reducir la fuerza de deformación y más bien presenta una recuperación lenta y gradual de la viscosidad. La tixotropía hace posible que una suspensión tenga alta consistencia en las condiciones de almacenamiento, no se sedimente en el recipiente, aumente su fluidez al agitarse y recupere rápidamente su consistencia para mantener las partículas en estado suspendido (Lee et al., 2009). Figura 10: Representación del comportamiento de un fluido con comportamiento tixotrópico. Tomado de Darvell, 2018. Algunos factores que afectan la reología de una suspensión son el contenido de solidos de la fase dispersa y la forma de las partículas, ya que medida que las partículas se desvían de la forma esférica, la suspensión se vuelve más viscosa. El tamaño de partícula también puede afectar la tixotropía, ya que las partículas más pequeñas se agregan a una velocidad mayor que las partículas más grandes. Una 48 suspensión con una distribución desigual de tamaños de partícula muestra una viscosidad más baja que una que tenga una distribución más estrecha (Acharya et al., 2018). Si una suspensión tiene demasiadas partículas pequeñas, estas tienden a colocarse en medio de partículas más grandes, reduciendo las interacciones entre las últimas. Las partículas más pequeñas y el medio de dispersión actúan como una fase pseudocontinua que transporta las partículas más grandes suspendidas, reduciendo el contenido efectivo de la fase dispersada y por lo tanto la viscosidad (Acharya et al., 2018). El aumento de la temperatura provoca generalmente una disminución de la viscosidad. La temperatura puede afectar la viscosidad de una suspensión al modificar las propiedades interfaciales, modificando la floculación. También puede afectar la viscosidad de un sistema al aumentar el movimiento browniano y causar la expansión del volumen tanto en el medio de dispersión como en los sólidos (Kulshreshtha et al., 2010). 3.3.4. Estudios de Estabilidad en Suspensiones El Comité de las Américas de Medicamentos Veterinarios (2017) establece lineamientos básicos para garantizar la calidad en todos los aspectos relacionados a la elaboración de medicamentos para uso animal. Los reglamentos técnicos centroamericanos como el RTCA 11.01.04:10 se refieren específicamente a los medicamentos de uso humano por lo que se revisará el documento equivalente para productos veterinarios. El CAMEVET (2012) como organismo que pretende armonizar las regulaciones y controles de los productos farmacéuticos veterinarios en los países parte genera una guía de estudios de estabilidad en productos medicinales para uso en animales. La guía divide los estudios de estabilidad según su objetivo específico: 49 1. Estudio Acelerado: Selección tomando en cuenta la estabilidad de las formulaciones y sistemas de envasado para establecer las condiciones de almacenamiento de este. 2. Largo Plazo: permiten determinar el periodo de vida útil y además las condiciones de almacenamiento. El proceso de evaluación farmacéutica relacionado con la estabilidad, se compone de diferentes pruebas químicas y físicas. La inestabilidad de los principios activos resultado de la influencia de diferentes factores como humedad, temperatura, pH, agentes oxidantes y la influencia de la luz pueden formar productos de degradación. El control de calidad en los productos farmacéuticos está generalmente relacionado con la determinación de las impurezas que puede ocurrir como resultado de las pruebas de estabilidad realizadas (Jamrógiewicz y Pieńkowska, 2019). Las condiciones en las que se realizan estas pruebas se determinan según la forma farmacéutica; en general la temperatura y la humedad son indicadores de la estabilidad al usarse como factores catalíticos de degradación. En el caso de los productos destinados a almacenarse a temperatura ambiente las condiciones del estudio acelerado son los establecidos por la zona climática IV (cálida y húmeda): 40±2 °C y 75±5% de humedad relativa en un tiempo de 6 meses. La estabilidad a largo plazo en productos destinados a ser almacenados a temperatura ambiente será evaluada con las condiciones de temperatura de 30±2 °C y 70±5% en el caso de la humedad relativa (CAMEVET, 2012; EMEA, 2005). Según los resultados de estas pruebas se obtiene la indicación de almacenamiento presente en la etiqueta. Para las condiciones de estudio mencionadas anteriormente la indicación en la etiqueta, luego de finalizados los estudios de estabilidad, corresponderá a: Almacenar a no menos de 15 y no más de 30°C en promedio. Además, la etiqueta incluirá advertencias respecto a la protección de la luz, la humedad y/o evitar la congelación del producto según sea el caso luego de las conclusiones derivadas del estudio de estabilidad (CAMEVET, 2012). 50 Las características de los estudios de estabilidad según EMEA (2005) son las siguientes: 1. El estudio de estabilidad acelerada tiene una duración mínima de 6 meses. Los estudios a largo plazo deben durar el mínimo de tiempo que se desee solicitar para el producto. 2. Para la frecuencia del muestreo, en los estudios acelerados se realiza un muestreo mínimo a 0, 3 y 6 meses. En el caso de estudios a largo plazo se realiza como mínimo cada 6 meses los primeros dos años del estudio (0,6,12,18 y 24 meses) y por cada año adicional mínimo cada 12 meses. 3. El tamaño y número de lotes a evaluar para la estabilidad acelerada son mínimo 3 lotes de tamaño piloto. Si los estudios se realizan para la comprobación del período de vida útil, aplican los estudios a largo plazo con un mínimo de 3 lotes de tamaño industrial. El proceso de manufactura aplicado en lotes piloto simula los producidos a nivel industrial y su tamaño será un mínimo del 10% del tamaño de un lote industrial, además de cumplir con la misma calidad y especificaciones propuestas para el producto (WHO, 2018). Los parámetros que serán evaluados a cada tiempo de muestreo incluyen todos aquellos que sean necesarios según las Farmacopeas oficiales de la forma farmacéutica en específico y que puedan ser utilizados para evaluar la estabilidad. Es importante identificar y cuantificar los productos de degradación cuando estos tengan relevancia terapéutica o toxicológica. En el caso de productos con múltiples principios activos se cuantifican todos los componentes como mínimo en el análisis inicial y final del estudio. Los análisis de esterilidad o recuento microbiano se realizarán mínimo al inicio y al final del estudio de estabilidad (CAMEVET, 2012). Los estudios se realizarán utilizando los mismos envases en los que se tiene planeado comercializar el producto. En el caso de productos comercializados en varias presentaciones y con empaques de diferente tamaño, los estudios deben 51 realizarse en el empaque con el menor tamaño, este es el que presentará las condiciones más desfavorables respecto a la relación de superficie del envase que estará en contacto con el producto. En el caso de envases de diferente material se realizarán estudios en cada uno de ellos, si se conoce o sospecha el material de envase que pueda provocar mayor deterioro sobre el producto, se realizará el estudio de estabilidad en este envase (WHO, 2018). Al final el estudio se requiere realizar un informe con la información relevante al estudio de estabilidad incluyendo las condiciones, metodología analítica, validación, cálculos estadísticos con el fin de respaldar el periodo de validez y las condiciones de almacenamiento propuestas para el producto (CAMEVET, 2012). Para el proyecto se tuvo como objetivo preparar todas las modificaciones propuestas junto con la documentación pertinente para que la compañía pueda dar inicio a los estudios de estabilidad. Para el cumplimiento de los requisitos respecto a la metodología analítica fue diseñada según la etapa 3 de este protocolo. 4. Metodología La metodología fue dividida en cuatro etapas, que comprendió en una revisión de bibliografía y de los registros existentes en Faryvet S.A. correspondientes al producto, luego la reformulación del producto para que la compañía pueda realizar la fabricación de lotes piloto e iniciar un estudio acelerado de estabilidad. Además, se revisó y completó la metodología analítica para el producto, con la cual se podrán realizar los controles de calidad necesarios para el estudio de estabilidad y los controles rutinarios de los lotes de producción. 4.1. Etapa 1: Revisión Bibliográfica y de Registros existentes del producto Se realizó una revisión bibliográfica respecto a: 1. Tecnología de producción de suspensiones. 2. Excipientes y vehículos apropiados para la formulación de suspensiones farmacéuticas estables. 52 3. Aspectos fisicoquímicos relevantes de los principios activos contenidos en el producto con el fin de realizar una propuesta de cambios en la formulación y en los procesos de fabricación. Además, se revisaron los registros relacionados con el producto en el laboratorio fabricante. Esta consistió en: 1. Revisión de la metodología analítica empleada hasta la fecha con la formulación original. 2. Documentos históricos de la fabricación de lotes del producto. 3. Registros de las modificaciones realizadas a la formulación o al proceso de fabricación. 4. Revisión de los resultados de los estudios de estabilidad realizados con el producto original hasta la fecha. 4.2. Etapa 2: Reformulación del producto 4.2.1. Análisis crítico de la Fórmula original Una vez reunida información suficiente para caracterizar los problemas de formulación presentados y el historial de fabricación del producto, se procedió a establecer las posibles causas de inestabilidad en la fórmula original y las estrategias de formulación que tendrían mayor impacto para solucionar el problema. Se propuso emplear una metodología de diagrama de Ishikawa para presentar este análisis. 4.2.2. Estudio de reformulación Una vez establecidas los principales problemas y causas de la inestabilidad de la suspensión se establecieron las diferentes estrategias de formulación del producto, como el análisis de la capacidad amortiguadora del buffer de citratos utilizado y el análisis de los pasos de fabricación establecidos, esto con base en el análisis derivado del diagrama de Ishikawa. En el producto reformulado se conservaron los aspectos organolépticos del producto original y no se realizaron modificaciones en cuanto al tipo y concentración de los saborizantes o colorantes. 53 La estabilidad de una suspensión se evaluó por su comportamiento de sedimentación, por ser fácil de observar. Esto se realizó utilizando un volumen conocido de las suspensiones prueba. El volumen fue vertido en probetas que fueron tapadas con papel Parafilm. Las suspensiones se dejaron en reposo durante 72 horas para permitir que ocurriera la sedimentación. Luego se realizaron estimaciones del volumen del sedimento (Aulton & Taylor, 2017). 4.3. Etapa 3: Fabricación de lotes piloto para estudio de pre-estabilidad Con el fin de obtener información preliminar con respecto a los cambios en la formulación, principalmente el caso de eliminar el sulfato de neomicina y luego para evaluar los cambios en el proceso de manufactura, se fabricaron lotes piloto de 1L y se recolectaron datos de estabilidad acelerada a tiempo cero, uno y tres meses. Se utilizaron los materiales de envasado, materias primas y equipo de Faryvet S.A. El método de fabricación desarrollado para los lotes piloto pretende servir como base para realizar una propuesta de método de fabricación de los lotes industriales. Con estos resultados se redactó el protocolo de estudio de estabilidad para la fabricación por parte del laboratorio de lotes piloto y el inicio de los estudios de estabilidad natural y acelerados. Este estudio permitirá evaluar los cambios realizados y recopilar información con respecto al efecto en la estabilidad de los envases de las presentaciones comerciales del producto 4.4. Etapa 4: Desarrollo de la metodología analítica para la nueva fórmula La siguiente etapa consistió en el diseño de la metodología analítica que será utilizada para la evaluación de la estabilidad y para el control de calidad de los futuros lotes de producción. Este aspecto es importante ya que, como parte del control de calidad rutinario no se realizan algunas pruebas como la determinación de viscosidad, el análisis cuantitativo del sulfato de neomicina o la identificación de los principios activos (en el caso de las sulfonamidas solo se reporta su cuantificación). Además, fue necesario efectuar ajustes menores con respecto a las especificaciones 54 y los métodos analíticos utilizados por Faryvet S.A. hasta la fecha para este producto. Las pruebas analíticas desarrolladas fueron las siguientes: Identificación de los Principios Activos: Los tiempos de retención fueron comparados contra los respectivos estándares de las tres sulfamidas con un equipo HPLC Thermo Scientific® acoplado a un detector UV-Vis de la misma marca empleando la metodología para su cuantificación. En el caso de la neomicina, el método que se establece en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP, 2018) es el de cromatografía en capa fina (Capítulo General <201>) y consisten en comparar una solución de la muestra con una solución estándar y la posterior detección de manchas por medio de un reactivo revelador. Apariencia: Al agregar la suspensión a una probeta graduada transparente se observó la uniformidad del color, la apariencia del sedimento, si hay grietas o burbujas de aire, si el líquido sobre el sedimento es uniforme o si existe material que se adhiere a las paredes. Esta prueba se realizó luego de permitir el reposo de la suspensión y que fuera visible la separación del sedimento (Nash 2013). Examen al microscopio: Se examinó la suspensión empleando un microscopio Olympus® Modelo CH30RF100 y una Cámara de Neubauer, con el fin de detectar cambios en la distribución de tamaños de partícula y el tamaño de los cristales y conglomerados de partículas sólidas (Nash 2013). Color, Olor y Sabor: Se realizó una caracterización organoléptica de la suspensión. Estas características son de importancia en suspensiones de administración oral. La 55 variación del color puede indicar distribución irregular de las partículas y diferencias de tamaño (Nash 2013). Volumen de Entrega: Se estableció según el Capítulo General <698> de la USP, con el fin de “garantizar que las preparaciones líquidas orales, cuando se transfieren desde su envase original, entreguen el volumen de la forma farmacéutica que se declara en la etiqueta” del producto. La prueba se aplica a productos que declaren contener no más de 250 mL, con una selección de 30 envases al azar y vaciando el contenido individual en probetas graduadas estableciendo el peso y volumen para cada recipiente (USP, 2018). Esta prueba no fue realizada en los lotes pilotos, a que por su tamaño no permitieron obtener los 30 envases, sin embargo, fue incluida dentro de las pruebas a realizar en el protocolo para el estudio de estabilidad. Velocidad de sedimentación, volumen de sedimento y facilidad de resuspensión: Se determinó el volumen de sedimento con el uso de una probeta graduada lo suficientemente grande para que sea fácil la resuspensión con agitación leve (Nash 2013). Gravedad Específica: La gravedad específica de la suspensión es un parámetro importante, su disminución en puede indicar la presencia de aire atrapado dentro de la estructura de la suspensión. Las mediciones de densidad (gravedad específica) a una temperatura dada se realizaron utilizando suspensiones que sean uniformes y bien mezcladas. La determinación de la gravedad específica se realizó utilizando un picnómetro de vidrio marca Kimax®. Viscosidad: Se utilizó un viscosímetro marca Brookfield® modelo DV-II +Pro (LV) para determinar las características reológicas de la suspensión y establecer los parámetros de operación del equipo para efectos de definir la especificación. 56 Valor de pH: Se midió el valor de pH de la suspensión a utilizando un pHmetro marca HANNA®. Recuento Microbiano: Esta prueba se realizó en el área de Microbiología de Faryvet SA utilizando los equipos e instalaciones con los que cuenta este laboratorio. Se realizaron pruebas únicamente posteriores a la fabricación del producto debido a que la cantidad fabricada no fue lo suficiente para dar un seguimiento a 1 y 3 meses. Según el Capítulo General <61> de la Farmacopea de los Estados Unidos USP 41 (2018), la prueba de recuento microbiano puede realizarse por dos técnicas generales: Filtración por Membrana y Método de Recuento en Placa. Para los objetivos de este proyecto se utilizó el Método de Recuento en Placa, según la metodología establecida por el laboratorio fabricante. La especificación consistió en un conteo de menos de 200 UFC de bacterias, menos de 20 UFC de hongos y la ausencia de E. coli, P. aeruginosa y S. aureus en 1 ml o 1 g de la muestra. Valoración de Sulfonamidas: Se empleó el método analítico de la compañía Faryvet empleando un equipo HPLC Thermo Scientific® acoplado a un detector UV-Vis de la misma marca, para realizar la cuantificación de las sulfonamidas en el producto. Valoración de Neomicina: Esta prueba se realizó en la sección de Bioanálisis del Laboratorio de Análisis y Asesoría Farmacéutica (LAYAFA®) utilizando los equipos e instalaciones con los que cuenta este laboratorio. Según el Capítulo General <81> de la Farmacopea de los Estados Unidos (2018), la “actividad (potencia) de los antibióticos puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre los microorganismos”. Se utiliza en este caso la valoración en cilindro-placa. Para el producto original esta prueba no se 57 realiza en el laboratorio fabricante, por lo que par