UNIVERSIDAD DE COSTA RICA FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS ESCUELA DE AGRONOMÍA INDUCCIÓN DE CALLOS PARA EL ESTABLECIMIENTO DE SUSPENSIONES CELULARES DE TEMPATE (Jatropha curcas) Tesis presentada para optar por el grado de Licenciatura en Ingeniería Agronómica con énfasis en Fitotecnia LAURA MIRANDA CARBALLO Ciudad Universitaria Rodrigo Facio San José, Costa Rica 2011 ii DEDICATORIA A la memoria de mi padre Bolívar y a mi madre Emma por su amor, su ejemplo, su sacrificio, su apoyo incondicional y por inculcar en mí los valores que han formado mi vida. A la memoria de mi hermana Luz Marina y a mis hermanos: Eida, Vilma, Rosa, Lorena, Lucía, Efraín y Lilliana, por su apoyo y por impulsarme a seguir siempre adelante. Gracias a ellos pude alcanzar esta meta. iii AGRADECIMIENTOS A la Dra. Laura Solís Ramos, directora de tesis, por su confianza, su apoyo, sus enseñanzas, su compromiso, su amistad y por su siempre buena disposición para atenderme y aconsejarme durante la realización de este trabajo. Al Lic. Luis Salazar Figueroa y a la M.Sc. Lorena Flores Chaves, por su amistad y su apoyo incondicional. A mi amiga Sia Georgieva Gosheva porque siempre estuvo anuente a colaborar conmigo cada vez que lo necesité. Al Dr. Arturo Brenes Angulo, Dr. Luis Gómez Alpízar, Dr. Eric Guevara Berguer y M.Sc. Álvaro Azofeifa Delgado, mis lectores por participar en el proceso de revisión y por las recomendaciones brindadas. A la empresa Inversiones J.S.S.A de Costa Rica por facilitar el material vegetal de tempate para realizar esta investigación. Al Dr. Mario Rodríguez Monroy, del Centro de desarrollo de productos bióticos (CEPROBI) por su colaboración durante el desarrollo de esta investigación. Al Centro de investigaciones en biología celular y molecular (CIBCM), a través de la M.Sc. Griselda Arrieta quien nos facilitó el agitador orbital. Al Dr. Gustavo Gutiérrez Espeleta, director de la Escuela de Biología, por permitirme realizar el trabajo experimental en un laboratorio perteneciente a dicha escuela. A la Dra. Marta Valdez Melara. iv A la Escuela de Biología de la Universidad de Costa Rica. A la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica por el financiamiento de este trabajo a través del proyecto 111-A9-097. Alvaro Azofeifa Delgado, M.Sc. Presidente Directora de Tesis ~ Arturo Brenes Angulo. Ph.D. Miembro del tribunal Luis Gómez Alpízar, Ph.D. Miembro del tribunal Miembro del tribunal Laura Miranda Carballo Estudiante V vi TABLA DE CONTENIDOS ÍNDICE DE CUADROS .............................................................................................................. viii ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................................. ix RESUMEN ................................................................................................................................... xii INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 1 OBJETIVOS .............................................................................................................................. 7 General .................................................................................................................................. 7 Específicos ............................................................................................................................. 7 REVISIÓN DE LITERATURA ..................................................................................................... 8 Generalidades del cultivo de tempate .......................................................................................... 8 Origen y distribución .............................................................................................................. 8 Descripción botánica .............................................................................................................. 8 Clasificación taxonómica........................................................................................................ 9 Compuestos presentes en las diferentes partes de la planta ...................................................... 9 Usos y aplicaciones del tempate ........................................................................................... 10 Cultivo in vitro de tejidos vegetales .......................................................................................... 12 Reguladores del crecimiento ................................................................................................. 12 Callo .................................................................................................................................... 14 Suspensiones celulares ......................................................................................................... 14 Aplicaciones del cultivo in vitro en tempate .......................................................................... 15 MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................... 20 Evaluación de la composición del medio y del tipo de explante para la inducción de callo de tempate .................................................................................................................................... 20 Inducción de callo a partir de tejido foliar ............................................................................. 20 Desinfección del material vegetal ..................................................................................... 20 Medio de cultivo para inducción de callo .......................................................................... 20 Evaluación y análisis de resultados ................................................................................... 21 Inducción de callo a partir de segmentos de hipocótilo .......................................................... 22 Desinfección de las semillas ............................................................................................. 23 vii Germinación de embriones cigóticos ................................................................................ 23 Medio de cultivo para inducción de callo .......................................................................... 23 Evaluación y análisis de resultados ................................................................................... 24 Evaluación de dos edades de callo para el establecimiento de suspensiones celulares de tempate ................................................................................................................................................ 25 Establecimiento de las suspensiones celulares ....................................................................... 25 Medio de cultivo para las suspensiones ............................................................................. 25 Edad y cantidad del callo utilizado para establecer las suspensiones celulares ................... 25 Evaluación y análisis de resultados ................................................................................... 25 RESULTADOS ........................................................................................................................... 27 Evaluación de la composición del medio y del tipo de explante para la inducción de callo de tempate .................................................................................................................................... 27 Inducción de callo a partir de tejido foliar ............................................................................. 27 Inducción de callo a partir de segmentos de hipocótilo .......................................................... 34 Evaluación de dos edades de callo para el establecimiento de suspensiones celulares de tempate ................................................................................................................................................ 39 DISCUSIÓN ................................................................................................................................ 46 CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 51 RECOMENDACIONES .............................................................................................................. 52 LITERATURA CITADA ............................................................................................................. 53 ANEXOS ..................................................................................................................................... 61 viii ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1. Clasificación taxonómica del tempate ............................................................................ 9 Cuadro 2. Porcentaje de compuestos químicos y energía presentes en la semilla de tempate ......... 10 Cuadro 3. Reportes previos de regeneración in vitro de tempate. .................................................. 17 Cuadro 4. Tratamientos que se aplicaron para la inducción de callo a partir de tejido folair de tempate ........................................................................................................................................ 22 Cuadro 5. Tratamientos que se aplicaron para la inducción de callo a partir de hipocótilos de tempate. ....................................................................................................................................... 24 Cuadro 6. Porcentaje de inducción y textura de callo 30 días después de aplicados los tratamientos con AIB y BA en distintas concentraciones. ................................................................................. 28 Cuadro 7. Coloración y textura del callo obtenido a partir de segmentos de hipocótilo de tempate 30 y 60 días después de aplicados los tratamientos con 2,4-D…………………………………………………………..36 ix ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Morfología del callo de 30 días de edad obtenido a partir de segmentos de tejido foliar de tempate tratado con diferentes concentraciones de AIB (0 – 2 mg/L) y BA (0 – 2,5 mg/L). ........... 30 Figura 2. Morfología del callo de 60 días de iniciada la inducción, obtenido a partir de segmentos de tejido foliar de tempate tratado con diferentes concentraciones de AIB (0 - 2 mg/L) y BA (0 – 2,5 mg/L). .......................................................................................................................................... 31 Figura 3. Ancho (cm) (± error estándar) del callo obtenido a partir de segmentos foliares de tempate tratado con AIB y BA, en diferentes concentraciones solos o en combinación, a los 30 y 60 DDI (días después de la inducción). ............................................................................................. 32 Figura 4. Peso (g) (± error estándar) del callo obtenido a partir de segmentos de tejido foliar de tempate tratado con AIB y BA, en diferentes concentraciones solos o en combinación, a los 30 y 60 DDI (días después de la inducción). ............................................................................................. 33 Figura 5. Callos de 30 días obtenido a partir de segmentos de hipocótilos de tempate tratado con diferentes concentraciones de 2,4-D. ............................................................................................ 35 Figura 6. Callos de 60 días de edad, obtenido a partir de segmentos de hipocótilos de tempate tratado con diferentes concentraciones de 2,4-D (0,5 –2,5 mg/L). . ............................................... 36 Figura 7. Ancho (cm) (± error estándar) del callo obtenido a partir de segmentos de hipocótilo de tempate a los 30 y 60 DDI (días después de la inducción). ............................................................ 37 Figura 8. Peso (g) (± error estándar) del callo obtenido a partir de segmentos de hipocótilo de tempate a los 30 y 60 DDI (días después de la inducción) ............................................................. 38 x Figura 9. Cinética de crecimiento medida a través de las variables de peso fresco (g/L) (A) y peso seco (g/L) (B) (± error estándar) de las suspensiones celulares de tempate establecidas con callo de 35 y 60 días de edad, durante un ciclo de 49 días. ........................................................................ 40 Figura 10. Suspensiones celulares obtenidas con callo de 35 días de edad obtenido a partir de segmentos de hipocótilo de tempate. a: 0 días, b: 7días, c: 14 días, d: 21 días, e: 28 días, f: 35 días, g: 42 días y h: 49 días. .................................................................................................................. 42 Figura 11. Suspensiones celulares obtenidas con callo de 60 días de edad obtenido a partir de segmentos de hipocótilo de tempate. a: 0 días, b: 7días, c: 14 días, d: 21 días e: 28 días, f: 35 días, g: 42 días y h: 49 días....................................................................................................................... 43 Figura 12. Cinética de crecimiento medida a través del % de volumen empacado de las suspensiones celulares de tempate establecidas con callo de 35 y 60 días de edad durante un ciclo de 49 días. ........................................................................................................................................ 44 Figura 13. Valores de pH de las suspensiones celulares establecidas con callo de 35 y 60 días ..... 45 xi Reguladores de crecimiento mencionados 2,4-D = Ácido 2,4-dichlorofenoxiacético BA = Benciladenina AIB= Ácido 3-indol butírico AIA= Ácido indol-3-acético TDZ= Tidiazurón GA3= Ácido giberélico xii RESUMEN En este trabajo se evaluó la composición del medio y del tipo de explante para la inducción de callos de tempate. Se trabajó con tejido foliar incubado en un medio adicionado con BA (0 – 2,5 mg/L) combinado con AIB (0 – 2 mg/L) y también con segmentos de hipocótilo incubados en un medio adicionado con 2,4-D (0 – 2,5 mg/L). Se evaluó el porcentaje formación de callos, la morfología de los callos (compacto y/o friable), color de los callos, peso fresco de los callos (g) y ancho de los callos (cm).Se obtuvieron callos compactos a partir de segmentos de tejido foliar incubados en un medio adicionado con BA y AIB. Se realizó una pequeña prueba para comprobar si era posible establecer suspensiones celulares a partir de estos callos, y el resultado fue negativo. A partir de los segmentos de hipocótilo incubado en el medio adicionado con 2,4-D se obtuvieron callos friables. Y se escogieron los callos obtenidos a partir del medio adicionado con 1,5 mg/L de 2,4-D para hacer el establecimiento de las suspensiones celulares. Se establecieron las suspensiones celulares en un medio MS (Murashige y Skoog, 1962) líquido con sacarosa al 3% y 1,5 mg/L de 2,4- D, estas suspensiones se incubaron con 1 g de callos de 35 y 60 días de edad. Se evaluó la cinética de crecimiento de dichas suspensiones, cada siete días durante 49 días y las variables evaluadas fueron: pH, volumen empacado (ml), peso fresco (g) y peso seco (g). Se obtuvo un mayor crecimiento cuando las suspensiones se establecieron con callos de 35 días. Palabras clave: tempate, callos, suspensiones celulares. 1 INTRODUCCIÓN El tempate (Jatropha curcas) es un arbusto perenne perteneciente a la familia de las euforbiáceas, originario de México y Centroamérica y que además se ha distribuido en África y Asia (Umer et al, 2010). En Costa Rica se le conoce comúnmente con el nombre de tempate (Heller, 1996) y tiene la ventaja de que puede cultivarse aún en condiciones adversas como lo son tierras degradadas y climas áridos (Makkar et al, 2009). En los últimos años, en países como China, Japón, Estados Unidos, India y Nueva Zelanda esta planta ha captado la atención de los científicos, ya que el aceite que se extrae de sus semillas es una fuente alternativa para la producción de biocombustibles (Ye et al, 2009). Las semillas del tempate contienen 48% de aceite viscoso que además de ser una fuente de biodiesel también se puede utilizar en la fabricación de otros productos útiles como candelas, jabón y cosméticos (Kochhar et al, 2005). Se han aislado una amplia variedad de compuestos químicos del tempate que tienen propiedades bactericidas (Zeng et al, 2004), molusquicidas (Cheng et al, 2001), insecticidas (Li et al, 2008) y fungicidas (Wei et al, 2004). El látex secretado por sus hojas y ramas es utilizado para tratar afecciones de la piel, también presenta actividad antiinflamatoria (Mujumdar y Misar, 2004) y anticoagulante y coagulante (Osoniyi y Onajobi, 2003). La curcina es una proteína aislada de las semillas de tempate que tiene un efecto antitumoral (Lin et al, 2003). Debido a la versatilidad del cultivo y al interés generado por el mismo, se ha establecido material vegetal propagado mediante semilla o estacas (Gübitz, 1999). J. curcas se puede reproducir por semilla obtenida a partir de polinización cruzada, sin embargo, este método introduce una alta variabilidad genética que puede afectar ciertas características deseables en planes de producción (Heller, 1996). La reproducción por medio de estacas, es un método con el que se puede mantener la uniformidad genética, pero el sistema radical que desarrolla la planta carece de una raíz primaria (Heller, 1996), generando subsecuentes problemas en el establecimiento de plantaciones. 2 Debido a la problemática presentada en cuanto a las formas de propagación de J. curcas el cultivo de tejidos es una herramienta efectiva y eficiente para la obtención de plantas (Ajay, 2008). Las técnicas de cultivo in vitro pueden constituir una alternativa como herramienta para la reproducción y el mejor aprovechamiento de las propiedades que posee el tempate (Sujatha et al, 2000). El cultivo in vitro de células y tejidos vegetales se refiere al conjunto de técnicas empleadas para hacer crecer células, tejidos y órganos bajo condiciones asépticas y controladas. (Hartmann et al, 2002). Se basa en el principio de totipotencia celular, que establece que a partir de cualquier célula es posible regenerar un individuo completo. Mediante esta técnica es posible obtener cultivos de células no diferenciadas como callos y suspensiones celulares (Razdan, 2003). El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta, a la que se le denomina explante, como por ejemplo el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc. y colocarla en un medio nutritivo estéril. La formulación del medio cambia según se quiera hacer crecer yemas y raíces, obtener embriones somáticos u obtener un tejido desdiferenciado llamado callo (Ziv y Chen, 2008). Se le denomina callo a la masa celular amorfa que se forma a partir de explantes colocados en un medio de cultivo suplementado con reguladores de crecimiento (George, 2008). Las suspensiones celulares consisten de células libres o pequeños agregados celulares colocados en medio líquido y que se mantienen en constante agitación, para su establecimiento se emplean callos que tengan la capacidad de disgregarse fácilmente. Tales suspensiones pueden ser mantenidas permanentemente mediante el suministro continuo de nutrientes a través de subcultivos (Kieran et al, 1997). Las suspensiones celulares que tienen alta capacidad de regeneración tienen aplicaciones en la propagación clonal masiva, criopreservación y manejo de germoplasma (Kosky et al, 2002), generación de mutantes o variantes de líneas celulares, el aislamiento de protoplastos, transformación genética y estudios fisiológicos y bioquímicos y también para la obtención de metabolitos secundarios (Ben Amar et al, 2007). 3 Hasta la fecha existe solo un reporte (Soomro y Memon, 2007), sobre el establecimiento de suspensiones celulares de tempate. Esta investigación plantea dar nuevos aportes en este sentido, estableciendo un protocolo de inducción de callo a partir del cual se puedan establecer suspensiones celulares de Jatropha curcas. En el futuro a partir de las suspensiones aquí obtenidas, se llevarán a cabo otras investigaciones sobre embriogénesis somática, crecimiento y diferenciación, estudios fisiológicos y bioquímicos, aislamiento de genes, extracción de metabolitos secundarios de interés farmacológico, agrícola e industrial, generación de mutantes o variantes de líneas celulares, aislamiento de protoplastos y transformación genética. En el material vegetal utilizado para realizar esta investigación se identificó una proteína de interés, que será extraída a partir de las suspensiones celulares aquí obtenidas, en un proceso de escalamiento en biorreactores, esto permitirá obtener mayor cantidad de la proteína de la que se podría obtener de las plantas en forma natural y en un período de tiempo más corto. Justificación En muchas especies vegetales se vuelve necesaria la micropropagación para la realización de muchos estudios que no se pueden llevar a cabo bajo condiciones no estériles o poco controladas. Esto a su vez garantiza la posterior realización de estudios más avanzados como los que involucran la transformación, embriogénesis somática, cultivo de células en suspensión, aislamiento de protoplastos y otras metodologías. Las cuales se han orientado a la optimización tanto de la organogénesis como de la embriogénesis somática como herramientas de micropropagación. En Jatropha curcas la regeneración in vitro ha sido descrita por varios autores: Sujatha y Mukta (1993), Sujatha y Mukta (1996), Manjari et al (2007), Rajore et al (2002), Sujatha et al (2005), Kalimuthu et al (2007) y Wei et al (2004). Estos estudios revelaron la capacidad de obtener la regeneración de plantas a partir de la organogénesis. 4 Asimismo la embriogénesis somática ha sido descrita también por: Jha et al (2007), Kalimuthu et al (2007) y Sardana et al (2000). Pero muy poco se ha trabajado en la obtención de suspensiones celulares, solo Soomro y Memon, (2007) han trabajado al respecto hasta ahora. Por otro lado, el creciente interés en sustancias de origen natural para la industria cosmética, agrícola, médica o farmacológica, justifican la realización de investigaciones que casi de manera obligatoria implican el cultivo de tejidos de esta especie. Por ejemplo se han hecho estudios y se ha determinado que las semillas del tempate contienen 48% de aceite viscoso que además de ser una fuente de biodiesel también se puede utilizar en la fabricación de otros productos útiles como candelas, jabón y cosméticos (Kochhar et al, 2005). Se han aislado una amplia variedad de compuestos químicos del tempate que tienen propiedades bactericidas (Zeng et al, 2004), molusquicidas (Cheng et al, 2001), insecticidas (Li et al, 2008) y fungicidas (Wei et al, 2004). El látex secretado por sus hojas y ramas es utilizado para tratar afecciones de la piel, también presenta actividad antiinflamatoria (Mujumdar y Misar, 2004) y anticoagulante y coagulante (Osoniyi y Onajobi, 2003). La curcina es una proteína aislada de las semillas de tempate que tiene un efecto antitumoral (Lin et al, 2003). Pese a lo anterior, durante los últimos cinco años muchos proyectos, tanto a nivel mundial como en Costa Rica, han sido desarrollados para la producción de aceite a partir de sus semillas como materia prima para la industria del biodiesel. Sin embargo, el aprovechamiento de especies comerciales para las diversas aplicaciones mencionadas a nivel mundial es escaso, y nulo para las especies nativas de Costa Rica. Por lo que el establecimiento de líneas celulares de J. curcas de Costa Rica, representa una gran alternativa para llevarlos al escalamiento en biorreactores, para la identificación de estas proteínas o metabolitos secundarios reportados, con el propósito de lograr su aplicación farmacológica, agrícola e industrial. El tempate no es una especie poco estudiada, lo que sucede es que la mayoría de la investigación que se han realizado con esta planta es relativamente reciente, basta solo con darse a la tarea de buscar información al respecto. 5 Tampoco es una especie resistente al ataque de enfermedades como se creyó en un principio, se han reportado daños por: Moho negro (Meliola jatrophae), mancha angular (Colletotrichum gloeosporioides), pudrición radical (Clitocybe tabescens, Phymatotrichum omnivorum) y roya (Phakopsora jatrophicola). (Horts, 2008). Si, es cierto que el tempate se puede propagar tradicionalmente mediante dos métodos, a partir de semillas obtenidas producto de la polinización cruzada y por medio de propagación clonal a través de estacas. Pero estos métodos presentan inconvenientes, el primero no garantiza transmitir las características exactas de sus progenitores ya que existe combinación del material genético y el segundo que para satisfacer una demanda grande habría que contar con mucho material. El cultivo in vitro se presenta como una herramienta ya que a través de él se pueden obtener gran cantidad de plantas con características de buena producción, resistencia a enfermedades y mejor adaptabilidad a condiciones ambientales. La justificación de hacer cultivo in vitro en esta investigación es que de manera natural no se pueden obtener los callos friables que son necesarios para llevar a cabo el establecimiento de las suspensiones celulares. Para satisfacer la demanda a gran escala y asegurar un suministro constante de materiales de siembra de calidad requiere el desarrollo de las técnicas de multiplicación masiva como los son las suspensiones celulares. De dichas suspensiones se realizará la extracción de una proteína de interés farmacológico que fue identificada recientemente, esta proteína puede ser obtenida de manera natural en la planta pero los contenidos en esta son muy bajos. Una de las formas de incrementar los niveles de esta proteína, sería mediante el escalamiento en biorreactores. Por lo tanto el propósito de este trabajo es establecer suspensiones celulares de Jatropha curcas a partir de las cuales se puedan extraer proteínas en niveles más altos de los que sería posible obtener en las plantas. Además el cultivo de células en suspensión ofrece una nueva alternativa para la producción de biomasa y ácidos grasos. 6 • La producción es libre de patógenos y agroquímicos. • El cultivo puede ser escalado • El cultivo se puede producir durante las 24 horas al día durante 365 días al año independiente de factores ambientales externos • Se evita hacer usos de terrenos que pueden ser dedicadas a cultivos destinados a satisfacer las demandas alimentarias de la población 7 OBJETIVOS General • Inducir callo friable para el establecimiento de suspensiones celulares de tempate (Jatropha curcas). Específicos 1. Determinar el explante más adecuado para la inducción de callo friable en tempate. 2. Definir la composición del medio de cultivo más adecuada para la inducción callo friable en tempate. 3. Evaluar dos edades de callo para el establecimiento de suspensiones celulares de tempate. 4. Evaluar la cinética de crecimiento de las suspensiones celulares. 8 REVISIÓN DE LITERATURA Generalidades del cultivo de tempate Origen y distribución Jatropha curcas es un miembro de la familia Euphorbiaceae, originario de México y Centroamérica (Heller, 1996). Es una planta muy resistente a condiciones climáticas adversas y crece en una amplia variedad de condiciones agroclimáticas, desde zonas áridas hasta zonas de alta pluviosidad, también en suelos pobres y degradados (Hooda y Rawat, 2006). Se supone que fue llevado por navegantes portugueses a colonias de África y Asia; actualmente está presente en forma natural o cultivada en varios países de América Latina, Sudáfrica, África Centro, Este y Oeste. En Asia se puede encontrar en la India y el Medio Oriente (Tang et al, 2007). En Costa Rica se le conoce con el nombre común de tempate (Heller, 1996). Descripción botánica El tempate es un arbusto perenne que puede vivir de 40 a 50 años, dependiendo de las condiciones de manejo que se le den (Hooda y Rawat, 2006). Puede alcanzar una altura de hasta 5 m, los tallos muestran un crecimiento articulado, con una discontinuidad morfológica en cada incremento. La inactividad en el crecimiento es inducida por fluctuaciones de precipitación, temperatura y luz. Su corteza es de color verde amarillenta y sus ramas pueden contener látex. Normalmente tiene una raíz central y cuatro laterales (Ye et al, 2009). El tempate tiene hojas alternas, 5-7 lobuladas con un tamaño que puede variar de 6 a 15 cm. La inflorescencia se forma en la parte terminal de las ramas y es compleja. La planta es monoica, presenta flores tanto femeninas como masculinas (ocasionalmente se presentan 9 flores hermafroditas) con diez estambres organizados en grupos de cinco, en dos verticilos distintos (Heller, 1996). La polinización es llevada a cabo por insectos. El fruto es trilocular y tiene forma elipsoidal, el exocarpo se mantiene carnoso hasta que las semillas maduran. Las semillas son negras y miden entre 1 y 2 cm (Heller, 1996). Clasificación taxonómica Según Brittaine y Lutaladio (2010) la clasificación taxonómica del tempate es la siguiente: Cuadro 1. Clasificación taxonómica del tempate (Brittaine y Lutaladio, 2010) Reino: Subreino: División: Clase: Subclase: Orden: Familia: Subfamilia: Tribu: Género: Especie: Plantae Tracheobionta Embryophyta Magnoliopsida Rosidae Malpighiales Euphorbiaceae Crotonoideae Jatropheae Jatropha Curcas Compuestos presentes en las diferentes partes de la planta Se ha podido aislar una amplia variedad de metabolitos secundarios y proteínas, presentes en las diferentes partes de la planta de tempate (Reddy y Pamidimarri, 2010). En las hojas y las ramas por ejemplo, se han encontrado triterpenos cíclicos como estigmasterol, 10 flavonoides como la apigenina, vitexina e isovitexina, dímero alcohol triterpeno y glucósidos flavonoides (Gübitz et al, 1999). En tallos y raíces se han hallado varios ácidos orgánicos, así como iridoides, saponinas, taninos y los diterpenos jatrofol y jatrofolona. En el látex, curcaciclina A y curcaciclina B; la corteza es rica en taninos y de esta se obtiene un tinte de color azul (Sirisomboon et al, 2007). Por otra parte, en las semillas se ha determinado la presencia de dulcitol, sacarosa, fitatos, saponinas, e inhibidores de la tripsina (Gübitz et al, 1999). En el cuadro 2 se muestra el resultado de las determinaciones de proteínas, lípidos, materia inorgánica, fibras y energía obtenidas en semillas de tempate (Brittaine y Lutaladio, 2010). Además, las semillas presentan un contenido de aceite viscoso del 34%, el cual si es posteriormente sometido a una transesterificación, se puede usar como fuente de biodiesel (Sirisomboon y Kitchaiyab, 2009). La fracción de aceite se compone tanto de grasas saturadas como lo son el ácido palmítico (14,1%), y el ácido esteárico (6,7%), y de ácidos grasos insaturados como el ácido oleico (47%) y el ácido linoleico (31,6%) (Augustus et al, 2002). Cuadro 2. Porcentaje de compuestos químicos y energía presentes en la semilla de tempate (Brittaine y Lutaladio, 2010). Contenidos % Endospermo Testa Proteína cruda 25,6 4,5 Lípidos 56,8 1,4 Materia inorgánica 3,6 6,1 Fibra neutral 3,5 85,8 Fibra ácida 3,0 75,6 Energía (MJ/kg) 30,5 19,5 Usos y aplicaciones del tempate El tempate es una planta de usos múltiples con muchos atributos y un potencial considerable. En algunos países se utiliza para prevenir o controlar la erosión y además se ha utilizado comúnmente como cerca viva para delimitar terrenos (Tang et al, 2007). 11 La primera aplicación comercial del tempate fue reportada en Lisboa, donde el aceite importado de Cabo Verde se utilizaba para la producción de jabón (Gübitz et al, 1999), el aceite también sirve de materia prima para la fabricación de candelas y productos de la industria cosmética (Kumar y Sharma, 2008). Hoy día el mayor objetivo del cultivo de tempate es la extracción de aceite de las semillas para ser utilizado como biodiesel (Foidl et al 1996, Openshaw 2000, Lu et al 2008, Vyas et al 2009). Esta actividad genera una fuente importante de empleo para un gran número de personas (Hooda y Rawat, 2006). Además se puede obtener biogás con un 70% de metano, al usar los desechos que quedan de las semillas una vez que han sido usadas para producir biodiesel (Staubmann et al 1997). El aceite y el extracto acuoso del aceite tienen potencial insecticida y se han utilizado en el control de insectos como el gusano del algodón y en plagas asociadas al cultivo del maíz (Kaushik et al, 2007). Se ha demostrado en experimentos a escala de laboratorio y en pequeñas pruebas de campo que sustancias como los ésteres de forbol que se han aislado del tempate, tienen propiedades molusquicidas y fungicidas (Kumar y Sharma, 2008). Varias partes de la planta tienen propiedades medicinales y se han utilizado tradicionalmente para el tratamiento de enfermedades como la ciática, la hidropesía, la parálisis, el reumatismo, la disentería, la diarrea y algunas enfermedades de la piel (Gübitz et al, 1999). En tribus de la zona de Rajastahn Bhil en la India, se prepara habitualmente una pasta a base del polvo de raíz de tempate que se utiliza de forma tópica para el tratamiento de la inflamación (Mujumdar y Misar, 2004). A raíz de esta práctica, los mismos autores, investigaron y demostraron la actividad antiinflamatoria de los extractos de la raíz en experimentos realizados con ratones, ya que encontraron que estos extractos poseen varios compuestos que interfieren en el metabolismo de los ácidos que participan en la vía ciclo- oxigenasa, que resulta en la formación de prostaglandinas, causantes de producir la inflamación. Por otro lado Osoniyi y Onajobi (2003), evaluaron la actividad coagulante del látex de tempate y encontraron que el látex puro del tempate reduce el tiempo de coagulación de la 12 sangre, con el látex diluido se aumentó el tiempo de coagulación y en diluciones más altas del todo la sangre no se coaguló. En investigaciones asociadas a enfermedades tumorales, se ha estudiado a la curcina, una proteína aislada de las semillas de tempate, y clasificada como una proteína de inactivación ribosomal, la cual se considera que tiene actividad antitumoral (Barbieri et al, 1993). Con base en este principio, Lin et al (2003) estudiaron la respuesta a la curcina de un cultivo de células cancerosas y uno de células normales y concluyeron que la curcina evidentemente tiene un efecto antitumoral y que sus mecanismos de acción están relacionados con la actividad de la N-glucosidasa. Cultivo in vitro de tejidos vegetales El cultivo de tejidos es el término usado para definir los procedimientos mediante los cuales se cultivan células, tejidos u órganos en medios nutritivos bajo condiciones asépticas y está basado en el principio de totipotencia celular, el cual establece que a partir de cualquier célula es posible regenerar un individuo completo (Hartmann et al, 2002). En las últimas décadas se han desarrollado diferentes sistemas de cultivos para células, tejidos y órganos vegetales (Razdan, 2003). Uno de estos sistemas son las suspensiones celulares, las cuales consisten en mantener y propagar células vegetales libres o en pequeños agregados celulares colocados en medio líquido y que se mantienen en constante agitación (Kieran et al, 1997). Se pueden establecer suspensiones celulares directamente de explantes colocados en el medio de cultivo o a partir de callo friable, el cual se obtiene en una etapa previa llamada inducción de callo. Este tejido es el resultado de la división de las células diferenciadas del parénquima y se puede obtener a partir de diferentes tipos de explantes (Mineo, 1990). Reguladores del crecimiento Existen sustancias químicas presentes de forma natural en las plantas, que en muy bajas concentraciones son capaces de regular el crecimiento y el desarrollo. A estas sustancias se 13 les conoce con el nombre de hormonas vegetales o sustancias del crecimiento vegetal (Razdan, 2003). A las sustancias químicas preparadas sintéticamente y que tienen funciones similares a las hormonas vegetales y que tienen la capacidad de modificar el crecimiento y el desarrollo en las plantas, se les conoce con el nombre de reguladores del crecimiento (Gaba, 2004). Los reguladores de crecimiento son fundamentales en el cultivo de tejidos, ya que estos compuestos orgánicos, distintos de los nutrientes, en pequeñas cantidades estimulan inhiben o modifican los procesos fisiológicos en las plantas. Los reguladores de crecimiento más usados en el cultivo in vitro son las auxinas y las citoquininas (Machakova et al, 2008). Las auxinas son ampliamente utilizadas en el cultivo in vitro de tejidos vegetales ya que a nivel celular controlan procesos básicos en la división y elongación celular, incrementan la flexibilidad de la pared celular, facilitando el acceso de nutrientes al interior de la célula y aceleran la síntesis proteica promoviendo el crecimiento (Machakova et al, 2008). Las auxinas ya sea solas o en combinación con las citoquininas promueven el crecimiento de callos, las suspensiones celulares y pueden regular la dirección de la morfogénesis (Chawla, 2009). Debido a que son capaces de controlar los procesos de división celular, las auxinas participan en la formación de meristemos que pueden dar origen a órganos definidos o a tejidos no organizados (Nick, 2009). En tejidos organizados están involucradas en el establecimiento y el mantenimiento de la polaridad y a nivel de las plantas su efecto más destacado es el mantenimiento de la dominancia apical y la mediación de los tropismos (Friml y Palme, 2002). En el cultivo de tejidos vegetales generalmente se requiere la aplicación de auxinas al medio de cultivo para inducir callo a partir de diferentes tipos de explantes. Dichas auxinas son capaces de alterar la genética y fisiología de los tejidos. Las células que responden a la auxina pueden volver a un estado indiferenciado y comenzar a dividirse (Machakova et al, 2008). Las auxinas también promueven la dispersión de las células en cultivos de suspensiones celulares (Guilfoyle y Hagen, 2001). 14 Las citoquininas por su parte estimulan la síntesis de proteínas y participan en el control del ciclo celular promoviendo la división y la diferenciación celular. También controlan, junto con otros reguladores, los procesos del desarrollo y la senescencia (Van Staden et al, 2008). Callo Un callo es la masa celular amorfa que se forma a partir de explantes colocados en un medio de cultivo suplementado con reguladores de crecimiento (Razdan, 2003). Cuando el explante se coloca en el medio de cultivo que contiene los reguladores de crecimiento, se desencadenan una serie de procesos y el metabolismo de las células que se encontraba en reposo cambia y comienza una división celular activa. Durante este proceso las células diferenciadas y especializadas cambian su estado y se convierten en células no especializadas (George, 2008). Durante el desarrollo del callo se pueden observar las siguientes fases: inducción: donde las células del inóculo inicial comienzan su crecimiento tanto en número como en tamaño; desdiferenciación y proliferación celular: que es cuando el callo aumenta su masa celular al máximo; inducción de la diferenciación: en la cual se obtienen meristemos, embriones y tejido vascular a partir de la masa celular del callo; y la fase de envejecimiento donde se pierde la capacidad de crecimiento acelerado (Ziv y Chen, 2008). Suspensiones celulares Una suspensión celular se puede definir como un conjunto de células individuales y agregados celulares de tamaño variable, que crecen y se desarrollan en un medio líquido en el que se hallan dispersas e incubadas con agitación constante (Razdan, 2003). Las suspensiones celulares se inician mediante la colocación de una porción de callo friable en un medio líquido que está en constante agitación, para promover la separación de las células que lo componen. El grado de dispersión celular en las suspensiones celulares está influenciado particularmente por la concentración de reguladores de crecimiento en el medio de cultivo, aunque no necesariamente se necesita de callo para establecer las 15 suspensiones, también se ha logrado al colocar directamente explantes en el medio líquido (Chawla, 2009). Cuando las células están en suspensión siguen un patrón de crecimiento típico, basado en los cambios que ocurren en la tasa de división celular (George, 2008). En una primera etapa las células se dividen lentamente y a esta fase se le llama fase de latencia; la segunda fase se llama exponencial y en ésta la división celular es más rápida; la tercera fase se llama fase lineal donde cesa el crecimiento; que es seguida por una cuarta fase en la que se presenta una tasa decreciente del crecimiento y se conoce con el nombre de fase de desaceleración progresiva; hasta que alcanza la última fase llamada estacionaria (Hartmann et al, 2002). Transcurridas estas fases las células se pueden transferir a un nuevo medio y el proceso se vuelve a repetir y bajo las condiciones adecuadas, las suspensiones se pueden mantener indefinidamente (Kieran et al, 1997). El mantenimiento de suspensiones celulares ofrece una serie de ventajas en términos de la reducción del tiempo de experimentación para lograr líneas celulares promisorias que puedan ser reproducidas y que mantengan las características parentales deseadas (Demey et al, 2004). Existen diversas aplicaciones del cultivo de células en suspensión, entre ellas: el establecimiento de líneas celulares, el estudio del ciclo celular, la producción de metabolitos secundarios, el estudio de las rutas de metabolitos secundarios, la extracción de enzimas y el aislamiento de genes, replicación de ADN y la transformación genética (Mineo 1990, Hartmann et al 2002). Aplicaciones del cultivo in vitro en tempate Para la propagación rápida y el mejoramiento genético de genotipos seleccionados de tempate se ha hecho uso de la aplicación de técnicas de cultivo in vitro de tejidos (Reddy y Pamidimarri, 2010). Sobre esta línea, Soomro y Memon (2007), lograron el establecimiento de suspensiones celulares de tempate utilizando segmentos de hipocótilo y 0,5 mg/L de 2,4- D en un medio MS, en la fase de inducción de callo y alcanzaron el máximo crecimiento en las suspensiones celulares en un medio suplementado con 0, 5 mg/L de 2,4-D. 16 También se ha logrado la regeneración de plantas de tempate mediante organogénesis, utilizando diferentes explantes como hipocótilo, tallo, hojas o pedúnculos en J. interregima (Sujatha y Mukta, 1993) y en J. curcas a partir de hipocótilos (Sujatha y Mukta, 1996), pecíolos y hojas (Sujatha y Mukta, 1996), nudos (Manjari et al 2007, Rajore et al 2002, Sujatha et al 2005, Kalimuthu et al 2007) y epicótilos (Wei et al, 2004). Asimismo, se ha reportado la adición de reguladores de crecimiento al medio MS, principalmente BA e IBA, los cuales han favorecido un alto porcentaje en la inducción y multiplicación de brotes de J. interregima (Sujatha y Mukta 1993) y J. curcas (Sujatha y Mukta 1996; Sujatha et al 2000; Wei et al., 2004). El uso de diferentes concentraciones y combinaciones de reguladores de crecimiento para la inducción de organogénesis en tempate se detallan en el cuadro 3. De acuerdo a los reportes sobre embriogénesis somática de tempate, se ha obtenido inducción de callo embriogénico y desarrollo de embriones a partir de tejido foliar utilizando diferentes concentraciones de kinetina, IBA y sulfato de adenina (Jha et al 2007), BA solo (Kalimuthu et al 2007) o en combinación con IAA (Sardana et al 2000). (Cuadro 3). 17 Cuadro 3. Reportes previos de regeneración in vitro de tempate. Referencia Tipo de Explante Reguladores Respuesta % de respuesta Soomro y Memon, 2007 Hipocótilo 0,5mg/L 2,4-D Inducción de callo 100 0,5mg/L 2,4-D Máximo crecimiento en suspensiones celulares - Jha et al. 2007 Hojas 2mg/L Kinetina Inducción de callos embriogénicos 56 0,2mg/L IBA + 0,5mg/L Kinetina +2,5mg/L Adenina Sulfato Embriogénesis 58 Kalimuthu et al. 2007 Hojas BA 2mg/L Embriogénesis 90 Sardana et al. 2000 Hojas 3mg/L BA + 3mg/L IAA Embriogénesis - Sujatha y Mukta. 1993 Hipocótilo 1mg/L BA +1mg/L IBA Inducción de brotes adventicios - Tallo 1mg/L BA +1mg/L IBA Inducción de brotes adventicios - Hoja 1mg/L BA +1mg/L IBA Inducción de brotes adventicios - Pedúnculo 1mg/L BA +1mg/L IBA Inducción de brotes adventicios - Sujatha y Mukta. 1996 Hipocótilo 0,5mg/L BA + 1mg/L IBA Inducción de brotes adventicios 95 Peciolo 0,5mg/L y 1mg/L BA + 1mg/L IBA Inducción de brotes adventicios 98 Hoja 0,5mg/L y 1mg/L BA +1mg/L IBA Inducción de brotes adventicios 50 18 Continuación Cuadro 3. Referencia Tipo de Explante Reguladores Respuesta % de respuesta Manjari et al. 2007 Explantes nodales 5mg/L BA + 10mg/L Adenina Sulfato Multiplicación de brotes 6,2 Explantes nodales 0,1mg/L IBA + 0,5mg/L Kinetina + 5mg/L Adenina Sulfato Multiplicación de brotes 30,8 Sujatha et al. 2005 Explantes nodales 2mg/L BA + 1mg/L TDZ Inducción de brotes adventicios 12,3 Kalimuthu et al. 2007 Hoja 2mg/L BA + 0,5mg/L IBA Inducción de brotes adventicios 90 Explantes nodales 1,5mg/L BA + 0,1mg/L IAA + 0,5mg/L Kinetina Inducción de brotes adventicios 30 Ajay y Sudhakar. 2008 Hoja 0,5mg/L BA + 0,1mg/L IBA + 0,5mg/L TDZ Inducción de brotes adventicios 53,5 1mg/L BA + 0,2mg/L GA3 + 0,25mg/L IAA + 0,5mg/L Kinetina Multiplicación y elongación de brotes 11,5 Sujatha et al. 2000 Hipocótilo 0,1 y 2 mg/dm3 BA + 1mg/dm3 IBA Inducción de brotes adventicios - 0,5mg/dm3 BA + 1mg/dm3 IBA Multiplicación y elongación de brotes - Wei et al. 2004 Epicótilos 0,5mg/L BA + 0,1mg/L IBA Inducción de brotes adventicios 38 0,5mg/L BA + 1mg/L IBA Multiplicación y elongación de brotes 44 Li et al. 2008 Cotiledones 1,5 mg/L BA + 0,05mg/L IBA + 0,5mg/L GA3 Inducción de brotes adventicios 94 19 Continuación Cuadro 3. Referencia Tipo de Explante Reguladores Respuesta % de respuesta Shirivastava y Banerjee, 2008 Nódulos axilares 3 mg/L BA + 1mg/L IBA + 25mg/L Ácido cítrico Inducción de brotes adventicios 10 50mg/L Glutamina + 15mg/L L-Argenina + 25mg/L Adenina Sulfato Inducción de brotes adventicios - Rajore y Batra, 2005 2mg/L BA + 0,5 mg/L IAA Inducción de brotes adventicios - Rajore et al. 2002 Explantes nodales 2 mg/L Kinetina + 1,5 mg/L IBA Inducción de brotes adventicios - Sharma et al. 2006 Embriones 1,25 mg/L NAA + 0,06 mg/L Zeatina Inducción de callo - 0,5 mg/L NAA + 0,06 mg/L Zeatina Inducción de brotes adventicios - Sardana et al. 1998 - 3mg/L GA3+ 3mg/L IAA - - Thepsamran et al. 2008 Meristemos apicales 0,5mg/L BA + 0,008mg/L IBA Inducción de brotes adventicios 82 Abreviaturas BA = Benciladenina IBA= Ácido 3-indol butírico IAA= Ácido indol-3-acético TDZ= Tidiazurón GA3= Ácido giberélico 20 MATERIALES Y MÉTODOS Evaluación de la composición del medio y del tipo de explante para la inducción de callo de tempate Inducción de callo a partir de tejido foliar Para llevar a cabo esta etapa se utilizaron hojas jóvenes de plantas provenientes de una finca ubicada en Guanacaste y propiedad del señor Julio Sánchez. Las plantas se transportaron hasta el laboratorio en un vehículo propiedad de la finca de procedencia y venían sembradas en bolsas plásticas negras especiales para almácigos. Todos los experimentos se llevaron a cabo en el Laboratorio de Biotecnología y Transformación Genética de Plantas de la Escuela de Biología de la Universidad de Costa Rica, ubicada en San Pedro de Montes de Oca, San José. Todos los reactivos utilizados en todos los experimentos, incluido el gelificante, fueron de marca Sigma-Aldrich. Desinfección del material vegetal Las hojas se lavaron con agua destilada durante cinco minutos, seguidamente se pusieron en una solución de tween 20 (3 gotas por cada 100 ml), luego se colocaron en una solución de Carbendazina al 0,5% durante cinco minutos y transcurrido este tiempo se lavaron tres veces con agua destilada estéril. Luego se desinfectó el material en la cámara de flujo laminar, con una solución de hipoclorito de sodio (cloro comercial al 3,5% de ingrediente activo) al 0,1% durante cinco minutos y seguidamente se realizaron tres lavados con agua destilada estéril. Medio de cultivo para inducción de callo Una vez desinfectadas las hojas, se procedió a cortar discos de 10 mm de diámetro con la ayuda de un sacabocados de golpe, estéril, y se colocaron con la superficie abaxial en 21 contacto con el medio. Se utilizó medio MS (Murashige y Skoog, 1962) semisólido, con sacarosa al 3%; 0,7% de agar y adicionado con 0,5 - 2,5 mg/L BA y 0,5 – 2 mg/L AIB, solos o en combinación como se muestra en el cuadro 4. El pH del medio se ajustó a 5,8 y se autoclavó en los frascos a 121°C y 6,8 kg/m2 durante 20 min. Los discos de hoja se cultivaron en frascos (tipo alimento para bebé) de 100 ml con 20 ml de medio, y se colocaron en el cuarto de crecimiento, con una temperatura de 26 ± 1°C y fotoperiodo de 16/8 h (luz/oscuridad). Se colocaron tres explantes por frasco y se realizaron tres repeticiones por tratamiento. Evaluación y análisis de resultados Para esta etapa se evaluaron las siguientes variables: • Porcentaje de formación de callo • Morfología del callo (Compacto, friable y muy friable) • Color del callo • Peso fresco del callo (g). En cada evaluación se introdujo la balanza en la cámara de flujo laminar, se tomó cada callo y se pesó. • Ancho del callo (cm). Esta medida se hizo midiendo el ancho del callo de un extremo a otro, con una regla graduada en cm. Se realizaron análisis descriptivos, así como análisis de varianza (ANOVA) para determinar diferencias significativas entre los tratamientos. Se utilizó el paquete estadístico STATISTICA (versión 1998). 22 Cuadro 4. Tratamientos que se aplicaron para la inducción de callo a partir de tejido foliar de tempate. Tratamiento AIB (mg/L) BA (mg/L) 1 0 0 2 0 0,5 3 0 1 4 0 1,5 5 0 2 6 0 2,5 7 0,5 0 8 0,5 0,5 9 0,5 1 10 0,5 1,5 11 0,5 2 12 0,5 2,5 13 1 0 14 1 0,5 15 1 1 16 1 1,5 17 1 2 18 1 2,5 19 2 0 20 2 0,5 21 2 1 22 2 1,5 23 2 2 24 2 2,5 Inducción de callo a partir de segmentos de hipocótilo Para llevar a cabo esta etapa se utilizaron semillas contenidas en frutos, provenientes de una finca ubicada en Guanacaste y propiedad del señor Julio Sánchez. Las semillas se extrajeron en el laboratorio. 23 Desinfección de las semillas Las semillas se colocaron en agua con jabón líquido para manos, marca Bactex, y se dejaron en agitación durante 24 h. Transcurrido este tiempo se les realizó tres lavados con agua destilada estéril. Seguidamente se lavaron con agua destilada y tween 20 (3 gotas por cada 100 mL) durante 10 minutos en agitación. Al cabo de este tiempo se les realizó tres lavados con agua destilada estéril. Luego se colocaron en una solución de Carbendazina al 1% durante 30 min en agitación y se realizaron tres lavados con agua destilada estéril. En la cámara de flujo laminar se colocaron las semillas en alcohol al 80% durante 5 min en agitación y se hicieron tres lavados con agua destilada estéril. Luego se lavaron con una solución de hipoclorito de sodio al 35% durante 15 minutos y transcurrido este tiempo se realizaron tres lavados con agua destilada estéril. Germinación de embriones cigóticos Una vez desinfectada la semilla se procedió a la extracción de los embriones, los cuales se pusieron a germinar en un medio MS (Murashige y Skoog, 1962) semisólido, con tiamina- HCl 10 mg/L, myo-inositol 100 mg/L, ácido giberélico 2 mg/L, sacarosa al 3% y 0,7% de agar. Este medio se dispensó en frascos (tipo alimento para bebé) de 100 ml y se colocaron 20 ml de medio por frasco. Los embriones permanecieron una semana en condiciones de oscuridad en este medio después de lo cual se subcultivaron a un MS (Murashige y Skoog, 1962) semisólido con sacarosa al 3% y 0,7% de agar, y se mantuvieron una semana en condiciones de 16/8 h (luz/oscuridad) Medio de cultivo para inducción de callo Para esta etapa se utilizaron los hipocótilos de las plántulas germinadas in vitro, los cuales se cortaron en segmentos de 5 mm y se colocaron en contacto con el medio MS (Murashige y Skoog, 1962) semisólido con sacarosa al 3% y 0,7% de agar y complementado con diferentes concentraciones de 2,4-D (Cuadro 5). El pH del medio se ajustó a 5,8 y se autoclavó a 121°C y 6,8 kg/m2 durante 20 min. Los segmentos de hipocótilo se cultivaron 24 en frascos (tipo alimento para bebé) de 100 mL de volumen y se pusieron 20 mL por frasco y se colocaron en el cuarto de crecimiento, a 26 ± 1°C y un fotoperiodo de 16/8 h (luz/oscuridad). Se colocaron tres explantes por frasco y se realizaron cinco repeticiones por tratamiento. Cuadro 5. Tratamientos que se aplicaron para la inducción de callo a partir de hipocótilos de tempate. Tratamiento 2,4-D (mg/L) 1 0 2 0,5 3 1 4 1,5 5 2 6 2,5 Evaluación y análisis de resultados Para esta etapa se evaluaron las siguientes variables: • Porcentaje de formación de callo • Morfología del callo (Compacto y/o friable) • Color del callo • Peso fresco del callo (g). En cada evaluación se introdujo la balanza en la cámara de flujo laminar, se tomó cada callo y se pesó. • Ancho del callo (cm). Esta medida se hizo midiendo el ancho del callo de un extremo a otro, con una regla graduada en cm. Se realizaron análisis descriptivos, así como análisis de varianza (ANOVA) para determinar diferencias significativas entre los tratamientos, se utilizó el paquete estadístico STATISTICA (versión 1998). 25 Evaluación de dos edades de callo para el establecimiento de suspensiones celulares de tempate Con base en los resultados obtenidos en la etapa anterior, se seleccionó el mejor tratamiento de inducción de callo friable. Establecimiento de las suspensiones celulares Medio de cultivo para las suspensiones Para esta etapa se utilizó medio MS (Murashige y Skoog, 1962) líquido con sacarosa al 3% complementado con 1,5 mg/L de 2,4-D. El pH del medio se ajustó a 5,8 y se autoclavó a 121°C y 6,8 kg/m2 durante 20 min. Edad y cantidad del callo utilizado para establecer las suspensiones celulares Se utilizó callo de 35 y 60 días de edad (no hubo transferencia a medio fresco antes de este tiempo). Se colocó 1 g de tejido en un erlenmeyer de 250 ml que contenía 50 ml de medio. Los erlenmeyers se colocaron en un agitador orbital a 160 rpm en el cuarto de crecimiento bajo las siguientes condiciones: temperatura de 26 ± 1°C y un fotoperiodo de 16/8 h (luz/oscuridad) Evaluación y análisis de resultados Se evaluó la cinética de crecimiento cada siete días, durante 49 días, las variables evaluadas fueron las siguientes: • pH, el cual se le midió a cada suspensión con la ayuda de un phmetro • Volumen empacado (ml), se colocó la suspensión en un tubo falcon graduado y una vez que se depositaron las células se midió el volumen que estas ocupaban. • Peso fresco (g), se filtraron las suspensiones y se pesaron en una balanza las células que quedaron en el papel filtro, antes de esto el papel filtro se llevó a peso constante, para obtener el peso de las células por diferencia. 26 • Peso seco (g), se obtuvo con la ayuda de una balanza, se llevó a peso constante cada una de las muestras. En cada evaluación se utilizaron tres réplicas para las variables de pH, volumen empacado, peso fresco y peso seco. 27 RESULTADOS Evaluación de la composición del medio y del tipo de explante para la inducción de callo de tempate Inducción de callo a partir de tejido foliar La formación de callo a partir de tejido foliar de tempate tratado con AIB y BA, solos o en combinación, se midió a través del porcentaje de inducción de callo, los resultados se muestran en el Cuadro 6. Con el tratamiento 1 o control carente de ambos reguladores AIB y BA, no hubo formación de callo, lo que muestra que el tejido foliar de tempate al ser colocado en un medio de cultivo sin reguladores de crecimiento no tiene la capacidad de generar una respuesta por sí mismo. A pesar de que el BA es una citoquinina y de que éstas promueven la división celular, en concentraciones de 0,5 y 1 mg/L (tratamientos 2, 3 y 4 respectivamente) no hubo respuesta del tejido. En contraste, con concentraciones más altas 2 y 2,5 mg/L (tratamientos 5 y 6 respectivamente) se dio formación de callo, pero el porcentaje de inducción fue menor comparado con los tratamientos donde se encontraban ambos reguladores combinados. Con la combinación de ambos reguladores de crecimiento en el medio a partir de concentraciones de 0,5 mg/L y hasta 2mg/L para el caso del AIB y de 1mg/L hasta 2,5mg/L para el de BA, se formó callo en el 100% de los explantes, es lo que muestra que la formación de callo se ve favorecida por la presencia de ambos reguladores. A mayor concentración de AIB y BA se obtuvo mayor formación de callo. 28 Cuadro 6. Porcentaje de inducción y textura de callo 30 días después de aplicados los tratamientos con AIB y BA en distintas concentraciones. Tratamiento AIB (mg/L) BA (mg/L) % de inducción de callo Textura 1 0 0 0 - 2 0 0,5 0 - 3 0 1 0 - 4 0 1,5 0 - 5 0 2 22 Compacto 6 0 2,5 67 Compacto 7 0,5 0 11 Compacto 8 0,5 0,5 67 Compacto 9 0,5 1 100 Compacto 10 0,5 1,5 100 Compacto 11 0,5 2 100 Compacto 12 0,5 2,5 100 Compacto 13 1 0 0 - 14 1 0,5 100 Compacto 15 1 1 100 Compacto 16 1 1,5 100 Compacto 17 1 2 100 Compacto 18 1 2,5 100 Compacto 19 2 0 0 - 20 2 2,5 100 Compacto 21 2 1 100 Compacto 22 2 1,5 100 Compacto 23 2 2 100 Compacto 24 2 2,5 100 Compacto 29 En la figura 1 se puede apreciar la apariencia de los explantes luego de 30 días de aplicados los tratamientos. Respecto a la morfología del callo, se obtuvo un callo compacto a los 30 y 60 días independientemente de la concentración de AIB y BA y de si éstos se encontraban solos o en combinación (Cuadro 6). El color del callo a los 30, días para todos los tratamientos fue en su mayoría blanco con algunas escasas tonalidades verdes. A los 60 días por el contrario casi la totalidad del callo fue de color verde y se empezaron a observar coloraciones café (Figura 1). Con el callo obtenido en este experimento se realizó una pequeña prueba para observar si era posible el establecimiento de suspensiones celulares, pero el resultado fue negativo, debido probablemente al hecho de que se un callo de tipo compacto y no friable, que sería el más apto para la obtención de suspensiones celulares. Lo cual demostró que el empleo de estos reguladores para inducción de callo no es el adecuado si el fin es lograr establecer suspensiones celulares. En la figura 1 se puede observar la coloración y la apariencia del tejido a los 30 días. Para esta fecha el color del callo obtenido en su mayoría fue blanco, de apariencia compacta y además se observó un patrón de formación de callo del borde hacia el centro del explante en todos los tratamientos. En el caso particular de los tratamientos 21, 22, 23 y 24 se nota que además de haber callo en los bordes también lo hay hacia el centro del explante pero solo sobre la venación del tejido foliar. 30 Figura 1. Morfología del callo de 30 días de edad obtenido a partir de segmentos de tejido foliar de tempate tratado con diferentes concentraciones de AIB (0 – 2 mg/L) y BA (0 – 2,5 mg/L). Barra= 1cm. 31 A los 60 días después de establecido el experimento de inducción de callo con AIB y BA su apariencia fue compacta y su coloración empezó a tornarse café. En el caso del tratamiento 22 se presentaron brotes adventicios (Figura 2). Figura 2. Morfología del callo de 60 días de iniciada la inducción, obtenido a partir de segmentos de tejido foliar de tempate tratado con diferentes concentraciones de AIB (0 - 2 mg/L) y BA (0 – 2,5 mg/L). Barra= 1cm. 32 El crecimiento del callo obtenido a partir de tejido foliar tratado con AIB y BA se cuantificó mediante su ancho y peso fresco (Figuras 3 y 4). Hubo un aumento en la longitud conforme aumentó la edad del tejido. La menor longitud se presentó en aquellos tratamientos en los que estaba ausente el AIB o en los cuales su concentración no superaba los 0,5 mg/L. A los 30 días no se observaron diferencias significativas en los tratamientos del 5 y 6 y del 8 al 18. El mayor valor de ancho se obtuvo con el tratamiento 22. A los 60 días la menor longitud fue para el tratamiento 7 con 1,50 cm y la mayor para el tratamiento 22 con 2,93 cm. Además no hubo diferencias significativas entre tratamientos del 9 al 23 (Figura 3). bcd ab a abc cd cd cd cd cd cd d d cd d AB A A BC BC BC BC BC BC BC BC D BC BC 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 5 6 7 8 9 10 11 15 16 18 21 22 23 24 A n ch o (c m ) Tratamientos 30 DDI 60 DDI AIB 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 1 1 2 2 2 2 BA 2 2,5 0 0,5 1 1,5 2 1 1,5 2,5 1 1,5 2 2,5 Figura 3. Ancho (cm) (± error estándar) del callo obtenido a partir de segmentos foliares de tempate tratado con AIB y BA, en diferentes concentraciones solos o en combinación, a los 30 y 60 DDI (días después de la inducción). (Letras minúsculas y mayúsculas muestran diferencias significativas entre fechas y letras distintas indican diferencias significativas). 33 Al comparar estadísticamente la interacción entre la edad del callo y el tratamiento para la variable de ancho, se observó que existen diferencias significativas ya que p = 0,000000. Con respecto a la variable de peso, los menores pesos se registraron en aquellos tratamientos en los que estaba ausente el AIB o donde no superaba los 0,5 mg/L. A los 30 días se midieron los mayores valores de peso con los tratamientos 9, 10, 11 y 21 pero no hubo diferencias significativas entre éstos. A los 60 días los mayores de peso se midieron con los tratamientos 10, 21, 22 y 24, pero tampoco hubo diferencias significativas entre ellos. El peso del tejido para todos los tratamientos aumentó conforme aumentó la edad (Figura 4). abcd abc a abcd d d d abcd abcd abcd d bcd abcd cd ABC A A ABC BC C BC ABC BC ABC C C ABC C 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 5 6 7 8 9 10 11 15 16 18 21 22 23 24 P e so ( g ) Tratamientos 30 DDI 60 DDI AIB 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 1 1 2 2 2 2 BA 2 2,5 0 0,5 1 1,5 2 1 1,5 2,5 1 1,5 2 2,5 Figura 4. Peso (g) (± error estándar) del callo obtenido a partir de segmentos de tejido foliar de tempate tratado con AIB y BA, en diferentes concentraciones solos o en combinación, a los 30 y 60 DDI (días después de la inducción).(Letras minúsculas y mayúsculas muestran diferencias significativas entre fechas y letras distintas indican diferencias significativas). 34 Al comparar estadísticamente la interacción entre la edad del callo y el tratamiento para la variable de peso, se observó que existen diferencias significativas ya que p = 0,000000. Una vez analizadas las variables en el experimento, se determinó que el callo obtenido a partir de segmentos de tejido foliar tratados con AIB y BA en diferentes concentraciones no es apto para el establecimiento de suspensiones celulares. Este callo es compacto y por lo tanto incapaz de disgregarse. El tejido apto para llevar a cabo el establecimiento de suspensiones celulares debe ser de tipo friable. Inducción de callo a partir de segmentos de hipocótilo Al evaluar el porcentaje de inducción de callo 30 días después de aplicados los tratamientos de 0,5 – 2,5 mg/L de 2,4-D se encontró una respuesta de 100% de inducción. No se obtuvo formación de callo en ausencia del regulador (control), lo que indica que la concentración de auxinas que pueda tener el explante por sí solo no es suficiente para que se dé la formación de tejido calloso. En la figura 5 se puede observar la respuesta obtenida a los 30 días, donde se nota como los segmentos de hipocótilo en el tratamiento control permanecen igual que cuando se estableció el experimento. Se puede observar, además de la diferente morfología, según cada uno de los tratamientos. Las diferencias en la coloración de los tejidos que se tratan con detalle en el cuadro 7. 35 Figura 5. Callo de 30 días obtenido a partir de segmentos de hipocótilos de tempate tratado con diferentes concentraciones de 2,4-D. Barra= 1cm. El color del callo obtenido fue en su mayoría verde claro en todos los tratamientos. Además, se observaron colores blanco (tratamiento 6) y café (tratamientos 2 y 3) (Figura 5), pero en un menor porcentaje. A los 60 días se mantuvo este patrón de coloración pero además apareció una tonalidad verde amarillenta en un mayor porcentaje en el tratamiento 4 (1,5 mg/L de 2,4-D), y también se presentó tejido de color amarillo en esta etapa (Figura 6). Con respecto al tipo de callo obtenido con los tratamientos 2, 3, 5 y 6, este fue friable, pero para el caso del tratamiento 4 fue clasificado de muy friable, esto en las dos fechas de evaluación (Cuadro 8). 36 Cuadro 7. Coloración y textura del callo obtenido a partir de segmentos de hipocótilo de tempate 30 y 60 días después de aplicados los tratamientos con 2,4-D. Tratamiento 2,4-D (mg/L) Apar iencia del callo 30 Días 60 Días Color (%) Morfología (%) Color (%) Morfología (%) Verde claro Blanco Café Friable Muy Friable Verde claro Verde amarillento Blanco Café Amarillo Friable Muy Friable 1 0 - - - - - - - - - - - - 2 0,5 53 13 34 100 - 73 0 0 27 0 100 - 3 1 47 40 13 100 - 47 13 20 20 0 100 - 4 1,5 100 0 0 - 100 0 60 40 0 0 - 100 5 2 60 13 27 100 - 33 0 22 0 45 100 - 6 2,5 100 0 0 100 - 27 40 13 7 13 100 - A los 60 días se observaron tonalidades café en los tratamientos 2, 3 y 6. El tratamiento 4 presentó un color verde amarillento (Figura 7). Figura 6. Callo de 60 días de edad, obtenido a partir de segmentos de hipocótilos de tempate tratado con diferentes concentraciones de 2,4-D (0,5 –2,5 mg/L). Barra= 1cm. El crecimiento del callo obtenido a partir de hipocótilos tratados con 2,4-D (0,5 - 2,5 mg/L) se cuantificó al medir el ancho y el peso fresco (Figuras 7 y 8). Conforme aumentó la edad del tejido también aumentó el tamaño de éste. A los 30 días no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos en los que se encontraba presente el 2,4-D. (Figura 7). 37 Al comparar estadísticamente la interacción entre la edad del callo y el tratamiento para la variable de ancho, se observó que existen diferencias significativas ya que p = 0,000000. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 1 2 3 4 5 6 A n ch o ( cm ) Tratamientos 30 DDI 60 DDI a b B b BC b b b CD BCD D 2,4-D 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Figura 7. Ancho (cm) (± error estándar) del callo obtenido a partir de segmentos de hipocótilo de tempate a los 30 y 60 DDI (días después de la inducción). (Letras minúsculas y mayúsculas muestran diferencias significativas entre fechas y letras distintas indican diferencias significativas). El peso presentó un comportamiento similar al de la longitud. Hubo una relación directamente proporcional entre la edad y el peso del tejido. A los 30 días se obtuvieron los mayores valores de peso con los tratamientos 4 y 6, pero entre sí no hubo diferencias significativas. A los 60 días el comportamiento en la variable de peso fue igual que a los 30 (Figura 8). Al comparar estadísticamente la interacción entre la edad del callo y el tratamiento para la variable de peso, se observó que existen diferencias significativas ya que p = 0,000000. 38 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 P e so ( g ) Tratamientos 30 DDI 60 DDI 2,4-D 0 0,5 1 1,5 2 2,5 a b B 2,4-D 0 0,5 1 1,5 2 2,5 a b b BC bc BC d C cd C Figura 8. Peso (g) (± error estándar) del callo obtenido a partir de segmentos de hipocótilo de tempate a los 30 y 60 DDI (días después de la inducción). (Letras minúsculas y mayúsculas muestran diferencias significativas entre fechas y letras distintas indican diferencias significativas). Los resultados del experimento de inducción de callo a partir de segmentos de hipocótilos de tempate tratados con 2,4-D, sugieren que el tratamiento más apto para llevar a cabo el establecimiento de las suspensiones celulares es el 4 (1,5 mg/L 2,4-D). Si bien es cierto, con los tratamientos 2, 3, 5 y 6 se obtuvo 100% de inducción y las diferencias entre los tratamientos 4, 5 y 6 para la variable de longitud no fueron significativas, el tratamiento 4 fue el que presentó una coloración y una consistencia muy friable. Por lo tanto, se escogió este tratamiento porque fue de los que presentó un mayor peso, una coloración diferente y porque su consistencia se clasificó como muy friable. 39 Evaluación de dos edades de callo para el establecimiento de suspensiones celulares de tempate Se seleccionó el callo obtenido a partir de segmentos de hipocótilo inducido en un medio adicionado con 1,5 mg/L de 2,4-D como el más apto para el establecimiento de las suspensiones celulares. Asimismo se seleccionó la misma composición del medio donde se indujo el tejido más apto para establecer las suspensiones celulares. Es decir el medio de las suspensiones es un medio MS (Murashige y Skoog, 1962) líquido con sacarosa al 3% adicionado con 1,5 mg/L de 2,4-D. Evaluación de callo de 35 y 60 días de edad para el establecimiento de suspensiones celulares de tempate El crecimiento de la suspensión fue cuantificado mediante la medición del peso fresco y el peso seco de las células y agregados celulares presentes en las suspensiones. Los resultados se muestran en la figura 9. Las curvas de peso fresco (g/L) y peso seco (g/L) que representan la cinética de crecimiento de las suspensiones establecidas con callo de 35 días, mostraron un comportamiento similar entre sí. De los 0 y hasta los 7 días el crecimiento fue muy poco. A partir del día 7 y hasta el 35 se presentó una fase de crecimiento. A partir del día 35 y hasta el 42 se observó un período de decrecimiento y del día 42 hasta el 49 no se presentaron variaciones. A los 35 días se obtuvo el mayor peso fresco y seco con un valor de 194,90 g/L para el primero y 6,59 g/L para el segundo (Figura 9 A). Por su parte las curvas de peso fresco (g/L) y peso seco (g/L) que representan el crecimiento de las suspensiones establecidas con callo de 60 días tuvieron un comportamiento diferente, en las dos de los 0 y hasta los 14 hubo muy poco crecimiento. A partir del día 14 y hasta el 21 se dio una fase de crecimiento. Del día 21 hasta el 35 se manifestó la fase de decrecimiento y del día 35 hasta el 49 se observó la fase estacionar 40 bc bc bc c b a a a 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 0 7 14 21 28 35 42 49 P e so F re sc o ( g / L ) Edad de la suspensión celular (días) 60 días 35 días (A) a ab ab ab ab b b ab a a a a a a a a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 7 14 21 28 35 42 49 P e so S e c o ( g / L ) Edad de la suspensión celular (días) 35 días 60 días (B) Figura 9. Cinética de crecimiento medida a través de las variables de peso fresco (g/L) (A) y peso seco (g/L) (B) (± error estándar) de las suspensiones celulares de tempate establecidas con callo de 35 y 60 días de edad, durante un ciclo de 49 días. (Letras distintas indican diferencias significativas). 41 A los 21 días se registró el mayor valor de peso fresco con 91,58 g/L y peso seco con 2,71 g/L (Figura 9 B). Para las suspensiones establecidas con callo de 35 días, la fase de crecimiento se extendió durante 28 días, mientras que para las suspensiones establecidas con callo de 60 tardó solo 7 días. Al comparar el crecimiento de las suspensiones celulares con base en la edad del callo utilizado para establecer las suspensiones, se observó un mayor crecimiento cuando el callo tenía 35 días de edad (Figura 9), presentándose una diferencia de 103,32 g/L en el valor del peso fresco, comparado con las suspensiones con callo de 60 días. En el caso del peso seco la diferencia fue de 3,88 g/L. Durante el período de evaluación se determinó el porcentaje de disgregación del callo y la coloración de las suspensiones establecidas con callo de 35 días de edad. Los resultados se pueden observar en la figura 10a. El día 0 el porcentaje de disgregación del callo fue de 100%. Con respecto al color de las suspensiones los días 0 y 7 presentaban un color translúcido (Figuras 10a y 10b). A partir del día 14 (Figura 10c) el color de las suspensiones empezó a cambiar mostrándose blanquecino desde el día 14 (Figura 10c) hasta el 28 (Figura 10e). A partir del día 35 (Figura 10f) y hasta el día 49 (Figura 10h) las suspensiones tomaron un color crema. Por otra parte, a partir del día 35 se empezaron a observar agregados celulares de considerable tamaño (Figura 10f), lo cual se refleja en la curva de crecimiento como un aumento considerable en el peso fresco y el peso seco (Figura 9). Para el caso de las suspensiones establecidas con callo de 60 días, a partir del día 0 el porcentaje de disgregación del callo fue igualmente de 100% (Figura 11a); sin embargo, la coloración de éstas suspensiones fue translúcida desde el día 0 y hasta el día 49 (Figuras 11a, 11b, 11c, 11d, 11e, 11f, 11g y 11h). 42 Figura 10. Suspensiones celulares obtenidas con callo de 35 días de edad obtenido a partir de segmentos de hipocótilo de tempate. a: 0 días, b: 7días, c: 14 días, d: 21 días, e: 28 días, f: 35 días, g: 42 días y h: 49 días. 43 Figura 11. Suspensiones celulares obtenidas con callo de 60 días de edad obtenido a partir de segmentos de hipocótilo de tempate. a: 0 días, b: 7días, c: 14 días, d: 21 días, e: 28 días, f: 35 días, g: 42 días y h: 49 días. 44 Otra variable por medio de la cual se midió el crecimiento de las suspensiones fue el porcentaje de volumen empacado. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 12. La curva de crecimiento basada en el porcentaje de volumen empacado de las suspensiones hechas con callo de 35 días de edad, presentó muy poco crecimiento de los 0 y hasta los 7 días. A partir del día 7 y hasta el 35 el crecimiento aumentó. A partir del día 35 y hasta el 42 hubo una caída y del día 42 hasta el 49 se mantuvo (Figura 12). 0 5 10 15 20 25 0 7 14 21 28 35 42 49 % V o lu m e n e m p a ca d o Edad de la suspensión celular (días) 35 días 60 días Figura 12. Cinética de crecimiento medida a través del % de volumen empacado de las suspensiones celulares de tempate establecidas con callo de 35 y 60 días de edad durante un ciclo de 49 días. En la curva de las suspensiones establecidas con callo de 60 días, no se distinguen claramente las fases de crecimiento y el porcentaje de volumen empacado en general fue más bajo que el de las suspensiones que se hicieron con callo de 35 días (Figura 12). 45 En la figura 13 se muestra el comportamiento del pH de las suspensiones celulares, se observó para el caso de las suspensiones establecidas con callo de 35 días de edad, que hasta el día 28 hubo una acidificación en el medio la cual se refleja en un descenso de los valores de pH. El día 35 hubo un aumento y el día 42 se volvió a presentar un descenso. No se presentaron diferencias significativas en los valores de pH para ningún día de evaluación (Figura 13). Para el caso de las suspensiones establecidas con callo de 60 días, el día 7 se obtuvo el mayor valor de pH a partir de ese día y hasta el día 35 se observó un descenso (Figura 13). a a a a a a a a a c bc b a a a a 4,60 4,80 5,00 5,20 5,40 5,60 5,80 6,00 6,20 6,40 0 7 14 21 28 35 42 49 p H Edad de la suspensión (días) 35 días 60 días Figura 13. Valores de pH de las suspensiones celulares establecidas con callo de 35 y 60 días. (Letras distintas indican diferencias significativas). Las condiciones de crecimiento de las suspensiones establecidas con callo de 35 días de edad (Figura 9) y la apariencia de dichas suspensiones (Figura 10) sugieren que la edad en 46 la que se puede realizar el subcultivo de las suspensiones es a los 28 días ya que si bien es cierto a los 35 días sigue habiendo un aumento en el crecimiento, la mayoría se debe a la presencia de agregados celulares gruesos, pero lo que interesa para el mantenimiento de las líneas, son las células en suspensión y no los agregados. 47 DISCUSIÓN Los resultados obtenidos en esta investigación mostraron que la composición del medio de cultivo utilizado es un factor importante que influyó en las respuestas en la etapa de inducción de callo. Es posible obtener la inducción y el crecimiento de callos cuando se manipula el medio de cultivo variando los nutrientes, pero en especial los reguladores de crecimiento (Preece, 2008). Para regular el crecimiento y la morfogénesis en el cultivo in vitro de tejidos vegetales se utilizan las auxinas y las citoquininas (Van Staden et al, 2008). En la primera etapa de este estudio, la etapa de inducción de callo, se evaluó la respuesta obtenida a partir del uso de dos medios de cultivo diferentes, en uno se utilizó una combinación de auxinas y citoquininas (BA y AIB) y en el otro se usó una auxina (2,4-D). En la primera etapa de inducción, al utilizar concentraciones de 1 - 2 mg/L BA y de 0,5 - 2 mg/L AIB, se obtuvo porcentajes de inducción de hasta 100% en aquellos tratamientos en los que se encontraban presentes ambos reguladores. Esto coincide con el hecho de que el BA y el AIB han mostrado ser dos reguladores de crecimiento efectivos para la inducción de callos en varios explantes de Jatropha curcas (Kumar et al, 2011). Por ejemplo, usando el BA en concentraciones de 0,1 - 1 mg/L en combinación con AIB en concentraciones de 0,5 - 1 mg/L, Sujatha y Mukta (1996) obtuvieron 100% de inducción de callo. Por otra parte al utilizar BA en concentraciones de 0,2 – 1 mg/L en combinación con AIB de 0,5 – 1,5 mg/L, Wei et al (2004), obtuvieron también 100% de inducción de callo. Otros estudios reportan porcentajes de inducción más bajos al utilizar dichos reguladores de crecimiento. Al utilizar 1 mg/L de BA y 0,5 mg/L de AIB, Ajay y Sudhakar (2008), obtuvieron un 62% de inducción de callo. Li et al (2008) alcanzaron 33% de inducción de callo compacto y amarillento usando 1,5 mg/L de BA y 0,05 mg/L de AIB, y Misra et al (2010) utilizando BA 0,25 – 1 mg/L y AIB 0,1 – 0,2 mg/L lograron porcentajes de inducción de callo de 51,8 a 70%. Los resultados obtenidos tanto en este estudio como en otras investigaciones, mostraron que para obtener formación de callo, se necesitó la presencia de al menos uno de los 48 reguladores y la respuesta dependió de la concentración. Estos resultados corresponden según Van Staden et al (2008) con el hecho de que un balance cuantitativo apropiado entre auxinas y citoquininas complementadas en el medio nutritivo y las que se encuentran en forma endógena en los explantes cultivados in vitro son esenciales para inducir división y elongación celular. A pesar de que se obtuvo callo en esta etapa de la investigación este no sirvió para llevar a cabo el establecimiento de las suspensiones celulares, debido a que era un tejido de tipo compacto y el callo que se requiere para establecer suspensiones celulares debe ser de tipo friable (Mineo, 1990), para que haya disgregación del material y se puedan presentar las etapas de crecimiento de las suspensiones. Esto coincide con los resultados obtenidos por Sujatha y Mukta (1996), Wei et al (2004), Ajay y Sudhakar (2008), Li et al (2008) y Misra et al (2010), los cuales utilizando AIB y BA en diferentes concentraciones, obtuvieron la inducción de un callo compacto. En la segunda etapa de inducción de callo se utilizó una de las auxinas más ampliamente utilizadas para iniciar cultivos de callos, el 2,4-D. En concentraciones de 0,5 – 2,5 mg/L se obtuvo 100% de inducción de callo friable, lo cual coincide con el reporte donde utilizaron una concentración de 0,5 mg/L y se obtuvo 100% de callo friable de Jatropha curcas (Soomro y Memon, 2007). El 2,4-D se ha utilizado también en otras investigaciones para la inducción de callo friable para establecimiento de suspensiones celulares. Por ejemplo Varisai et al (2004) utilizando una concentración de 2 mg/L de 2,4-D en segmentos de tejido foliar de Macrotyloma uniflorum (Lam.) Verdc. obtuvieron un porcentaje de inducción de callo de 48,6%. Khafagi (2007) obtuvo callo para el establecimiento de suspensiones celulares de Peganum harmala usando 0,5 mg/L de 2,4-D. Deo et al (2009) obtuvieron 20,4% de callo utilizando 0,5 y 1 mg/L de 2,4-D en Colocasia esculenta var. esculenta. Si bien los reguladores de crecimiento son fundamentales en las respuestas de crecimiento y morfogénesis in vitro, estos procesos también se rigen por las propiedades del explante utilizado (Preece, 2008). En esta investigación se utilizaron dos tipos de explantes en la etapa de inducción. Se utilizó tejido foliar en el medio adicionado con BA y AIB y se 49 utilizó hipocótilo en el medio adicionado con 2,4-D. Para el primer caso se obtuvo un alto porcentaje de inducción de callo, pero su consistencia fue compacta. Cuando se utilizó hipocótilo como explante se obtuvo también altos porcentajes de inducción y una consistencia de tipo friable. Ello coincide con los resultados obtenidos por Soomro y Memon (2007), quienes utilizando hipocótilo de J. curcas y una concentración de 0,5 mg/L obtuvieron un 100% de inducción de callo friable. Sin embargo cuando utilizaron tejido foliar para esa misma concentración de 2,4-D, la respuesta obtenida fue de 40% de inducción y un tejido compacto, lo que sugiere que la respuesta obtenida también depende del tipo de explante que se utilice. En esta investigación se obtuvieron callos con diferentes características, de las cuales la morfología y el color fueron fundamentales para decidir el tejido a utilizar para el establecimiento de las suspensiones celulares. Con respecto a la coloración del callo obtenido, la coloración verde es producto de la presencia de clorofila y el color amarillo resulta probablemente de la existencia de carotenoides en los tejidos, cuando el callo se torna café es porque probablemente constantemente disminuyen los carotenoides y la clorofila y ésta disminución ocurre paso a paso durante los subcultivos. Una coloración café en callos resulta en la disminución de la habilidad regenerativa, escaso crecimiento e incluso la muerte del tejido (He et al, 2009), lo anterior sugiere que un tejido de color café probablemente no sea apto para el establecimiento de suspensiones celulares. La aparición de una coloración café puede estar asociada a un proceso de oxidación de diferentes componentes celulares causado por radicales libres o también a la oxidación de compuestos fenólicos, el proceso de oxidación puede producir compuestos químicos muy reactivos que generan daño e incluso la muerte celular (Bray et al, 2000). Soomro y Memon (2007) establecieron suspensiones celulares de tempate con callo verde y friable obtenido a partir de segmentos de hipocótilo, lo cual coincide con los resultados obtenidos en esta investigación. En otras especies también se han establecido suspensiones con callo friable. Por ejemplo en Beta vulgaris L. (Gürel et al, 2002); Arabidopsis thaliana (Doelling y Pikaard, 1993); Solanum tuberosum L (Torabi et al, 2008); Melastoma 50 malabathricum (Keng et al, 2008); Sorghum dimidiatum Stapf (Mythili et al, 1999); Orthosiphon stamineus (Lee y Chan, 2004). El callo para establecer las suspensiones celulares se seleccionó con base en los resultados obtenidos en la etapa de inducción. Se seleccionó un tejido de color verde amarillento y morfología friable obtenido a partir de hipocótilos en un medio adicionado con 1,5 mg/L de 2,4-D. Para evaluar el crecimiento, las suspensiones se establecieron en un medio adicionado con 1,5 mg/L de 2,4-D, con un gramo de tejido de 35 y 60 días de edad. Soomro y Memon (2007) establecieron suspensiones de Jatropha curcas con callo de cuatro semanas de edad trasferido a un medio líquido adicionado con 0,5 mg/L de 2,4-D. Otros autores han establecido también suspensiones celulares de otras especies utilizando un medio adicionado con 2,4-D (Lee y Chan, 2004; Mythili et al, 1999; Doelling y Pikaard, 1993). Los resultados obtenidos mostraron que el crecimiento de las suspensiones celulares de Jatropha curcas se vio influenciado por la edad del inóculo, ya que al medir las variables se obtuvieron valores más altos cuando se utilizó un callo de 35 días. La utilización de callo de 60 días de edad influyó negativamente sobre el crecimiento ya que se obtuvieron valores más bajos de peso fresco, peso seco y volumen empacado. Al estudiar la influencia de la edad del callo sobre el establecimiento de suspensiones celulares de cafeto, se determinó que con callos de 28 y 35 días de edad se obtenía un mayor crecimiento celular y se observó una tendencia de disminución del crecimiento al aumentar la edad del callo, esto debido a que tejidos más jóvenes tienen altas tasas de crecimiento y proliferación comparado con tejidos de mayor edad (Gonzáles et al 2010). Los subcultivos de las suspensiones de tempate se podrían realizar a los 28 días, ya que para esa fecha se observó un aumento del crecimiento debido en su mayoría a células en suspensión y no a la presencia de agregados celulares como los que se observaron el día 35. Soomro y Memon (2007) reportaron el mayor crecimiento en sus suspensiones de Jatropha curcas el día 21. 51 CONCLUSIONES • El callo obtenido a partir de tejido foliar colocado en un medio con AIB (0 – 2 mg/L) y BA (0 – 2,5 mg/L) solos o en combinación, no es apto para establecer suspensiones celulares tempate ya que su consistencia tiende a ser compacta. • El callo obtenido a partir de segmentos de hipocótilo inoculados en un medio con 4,4 g/L de MS; 30 g/L de sacarosa y 1,5 mg/L de 2,4-D, es el más apto para ser usado en el establecimiento de suspensiones celulares de tempate. • Se pueden establecer suspensiones celulares con callo de 35 y 60 días de edad, pero se obtiene un mayor crecimiento cuando el callo es más joven (35 días). • Con callo de 35 días de edad se obtienen mayores valores de peso fresco (g), peso seco (g) y de porcentaje de volumen empacado al establecer suspensiones celulares de tempate. • Con callo de 60 días de edad se obtienen menores valores de peso fresco (g), peso seco (g) y de porcentaje de volumen empacado al establecer suspensiones celulares de tempate. • La etapa de crecimiento es más larga en suspensiones establecidas con callo de 35 días de edad que en las suspensiones establecidas con callo de 60 días de edad. 52 RECOMENDACIONES • Evaluar diferentes composiciones de medio de cultivo en el establecimiento de suspensiones celulares. • Evaluar diferentes cantidades de callo en el establecimiento de suspensiones celulares. • Evaluar diferentes cantidades de medio para el establecimiento de suspensiones celulares. • Evaluar diferentes fuentes de carbono en el medio para el establecimiento de suspensiones celulares. • Evaluar diferentes condiciones lumínicas para el establecimiento de las suspensiones celulares. • Evaluar diferentes tamaños de erlenmeyers para el establecimiento de las suspensiones celulares. 53 LITERATURA CITADA Ajay, D.; Sudhakar, T. 2008. 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