Programa de Posgrado en Microbiología, Parasitología y Química Clínica e Inmulogía
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Item Diagnóstico de infecciones causadas por Brucella ceti en cetáceos(2011) Hernández Mora, María Gabriela; Moreno Robles, EdgardoLa brucelosis en cetáceos es causada por Brucella ceti y debido a la biología de estos animales, el acceso a nivel mundial a individuos positivos y en los cuales se haya logrado aislar esta bacteria es limitado. A nivel nacional, de 1O delfines rayados (Stenella coeruleoalba) encallados vivos o muertos en las costas del Pacífico, se logró aislar B. ceti a partir de tejidos del sistema nervioso central, líquido cefalorraquídeo, tejido del sistema retículoendotelial y reproductivo por lo que se pudo estudiar los hallazgos patológicos y por primera vez describir la sintomatología clínica presentada por estos animales confirmados como positivos. Así se determinó que esta bacteria además de producir problemas reproductivos, tal y como se ha descrito para otras especies del género Brucella, es capaz de causar la muerte en estos animales por meningoencefalomielitis y endocarditis, lo que no es usual en otros hospederos terrestres, excepto en humanos. Además, se logró diseñar y desarrollar un inmunoensayo ligado a enzimas indirecto (iELISA) en el que se utilizaron los sueros control obtenidos de estos animales. Tomando en cuenta la diversidad de especies existentes de cetáceos a nivel mundial, se desarrolló un conjugado con peroxidasa que reconociera las inmunoglobulinas G (G+L) de 17 especies diferentes como un único grupo. Para la estandarización se utilizaron los lipopolisacáridos de Brucella melitensis y Brucella- abortus, muestras de suero de 7 odontocetos en cautiverio sin historia de enfermedad infecciosa, negativos en la prueba de Rosa de Bengala (RBT) y muestras de 7 delfines infectados con B. ceti. Debido a la ausencia de una prueba de oro estándar, se comparó el rendimiento del iELISA desarrollado con inmunoensayos que usan proteína G (gELISA), ELISA competitivo (cELISA), Inmunofluorescencia (IF) y prueba Dot Blot (DB), usando como referencia el RBT en 179 muestras de su...Item Aislamiento y caracterización bioquímica y toxicológica de una fosfolipasa acída del veneno de Bothrops Asper(2010) Fernández Ulate, Julián; Lomonte Vigliotti, BrunoLas fosfolipasas A2 (PLA2s) son uno de los principales componentes de los venenos de serpiente y ejercen una gran variedad de actividades tóxicas como neurotoxicidad y miotoxicidad, entre otras. Dado que la mayoría de PLA2s tóxicas son proteínas básicas, las isoformas acídicas y sus posibles papeles en los venenos son menos conocidos. En este trabajo, una enzima acídica (BaspPLA2-II) fue aislada del veneno de Bothrops asper (región del Pacífico de Costa Rica) y caracteriz.ada. BaspPLAi-II es monomérica, con una masa de 14.212±6 Da y un punto isoeléctrico de 4,9. Su secuencia completa de 124 aminoácidos se dedujo a través de su ADN copia y mediante la secuenciación automatizada de sus aminoácidos. Pertenece al grupo Asp49, de enzimas catalíticamente activas. Ensayos in vivo e in vitro demostraron que BaspPLA2-II, en contraste con las PLA2s básicas Asp49 presentes en el mismo veneno, carece de actividad miotóxica, citotóxica y anticoagulante. La enzima BaspPLA2-II también se diferenció de otras PLA2s acfdicas descritas en venenos de Bothrops spp., ya que no generó hipotensión ni inhibición de la agregación plaquetaria. Además, esta enzima no fue letal para ratones, con dosis intravenosas de hasta 100 μg (5,9 μg/g), lo que indica su falta de actividad neurotóxica. El único efecto tóxico registrado in vivo fue una inducción moderada de edema local. Por lo tanto, las características toxicológicas de BaspPLA2-II sugieren que no juega un papel clave en la fisiopatología del envenenamiento por B. asper y que su papel estaría limitado a funciones digestivas. Los análisis inmunoquímicos con anticuerpos contra BaspPLAi-II revelaron que las PLA2s acíclicas y básicas forman dos grupos antigénicamente diferentes en el veneno de B. asper.Item Panel de Gtpasas glicosiladas por diferentes TcdBs de Clostridium difficile y su relación con el potencial patogénico de distintas cepas(2016) López Ureña, Diana; Chaves Olarte, EstebanEstudios recientes han demostrado que TcdB es el principal factor de virulencia de Clostridium difficile y que las variaciones en virulencia que se presentan entre las distintas cepas, podrían estar relacionado con esta toxina, tal como en el caso de la cepa epidémica NAP1 y las cepas que presentan una TcdB variante, Sin embargo, no se conoce con exac titud cuál es el papel que tienen estas distintas TcdBs sobre el potencial1 patógeno de las cepas. Por tanto, en este trabajo se analizaron cuatro toxinas distintas (TcdBNAP1, TcdBNAP1v , TcdBNAP9 y TcdBvpI10453) con el fin de dilucidar el papel del panel de sustratos modificados por estas proteínas en la patogénesis de C. difficíle. Por medio de ensayos de glicosilación se determinó el espectro de GTPasas modificadas, y se determinaron los efectos celulares inducidas por las distintas TcdBs en términos de efecto citopático (CPE), muerte celular y activación inmune. Asimismo , se evaluó el potencial patogénico asociada a cada TcdB. por medio del ensayo de asa ligada en ratón. Por medio de ensayos in vítro y ex vívo se determinó que TcdBNAP1 es capaz de glicosilar un panel más amplio de sustratos. Esta toxina es capaz de glicosilar a las GTPasas Rho y Ras, mientras que TcdBvP10463 sólo modifica a RhoA, Rac1 y Cdcd42, y TcdBNAP1v y TcdBNAP9 glicosilan a Rac1 y R-Ras. Una comparación de la cinética de estas proteínas en distintas líneas. celulares ireveló die manera indirecta, que la tasa de entrada a las células eucariotas es similar para todas las toxinas a pesar de que sólo TcdBNAP1 y TcdBNAP1v comparten los dominios de unión al receptor y de autoprocesamiento. En cambio, el tipo de CPE causado por cada toxina seasocia a un dominio glicosiltransferasa (GTD) similar. Aunado a esto, los eventos biologicos asociados a la intoxicación parecen relacionarse con el pane de sustratos...Item Detección y caracterización molecular de Anaplasma Phagocytophilum en garrapatas de perros y sangre de perros y equinos de diversas regiones de Costa Rica(2015) Campos Calderón, Lilliana; Dolz Wiedner, GabyAnaplasma phagocytophilum es el agente causal de la anaplasmosis granulocítica que afecta tanto a los humanos como a diversas especies de animales domésticos y silvestres por lo que tiene impacto en la salud veterinaria y pública. En Costa Rica, hasta el momento, no se han realizado estudios moleculares para determinar su presenciaenposibles vectores y animales domésticos hospederos; por lo que el principal objetivo de este trabajo fue determinar la presencia A. phagocytophilum en muestras de garrapatas de perros, así como sangre de perros y caballos de diferentes regiones de Costa Rica, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Además se buscó identificar molecularmente las cepas presentes mediante análisis de secuenciación. Para ello se analizaron fragmentos del gen ARNr 16S de A. phagocytophilum de 161 muestras de garrapatas de perros, 420 muestras de sangre de perros y 339 muestras de sangre de equinos. Las muestras que resultaron positivas para este gen fueron analizadas con pruebas de PCR de diferentes regiones genómicas de especies de Anaplasma específicas: msp2 de A. phagocytophilum y groEL de A. phagocytophilum, Anap!asma p!atys, Anap!asma p/atys-likey Anaplasma phagocytophilum-variante Japón. Se determinó que dos (1.24%) muestras de garrapatas (Rhipicephalus sanguineus s.I.), tres (0.71 %) muestras sanguíneas de perros y ninguna muestra sanguínea de equino fueron positivas en el PCR del ARNr 16S. El análisis de las secuencias obtenidas para este gen confirmaron la presencia de A. phagocytophilum en las dos muestras de garrapatas pero no fueron concluyentes para establecer la especie de Anaplasma presente en las tres muestras de sangre de perros, ya que presentaron porcentajes de homología similares con A. phagocytophilum, A. platys y Candidatus Anap/asma camelii. La comparación general de las cinco secuencias obtenidas, muestra que no son idénticas entre sí...Item Caracterización de doce nuevos alelos observados en una muestra costarricense en el marcador STR de uso forense D18S51(2009) Morales Valverde, Ana Yanssy; Silva de la Fuente, Sandra MaríaEl Departamento de Ciencias Forenses en Costa Rica estudió aproximadamente 10,000 transferencias alélicas de padre/hijo y 14,500 madre/hijo utilizando los sistemas PowerPlex®16 y/o AmpF/STR®Identifiler® para detectar desviaciones de los patrones mendelianos de herencia esperados. En ambos sistemas se incluye el marcador de pequeñas repeticiones en tándem (STR) D18S51, un STR altamente polimórfico con una escalera de alelos conocidos en el rango de 7-27 repeticiones y que se encuentra ampliamente incluido en las Bases de ADN en el mundo. Se observó un patrón que sugería la presencia de alelos nulos o silentes en el locus D18S51 en 25 transmisiones alélicas paternas y en 43 maternas, puesto que tanto el progenitor como el hijo aparentaban ser homocigotos para diferentes alelos en el mismo locus Las exclusiones con perfiles homocigotas en D18S51 fueron previamente asociadas con patrones trialélicos en el locus Penta E cuando eran detectados por PowerPlex®16. Los presuntos alelos nulos fueron reanalizados con el uso de un juego de imprimadores alternos. Los 68 casos mostraron perfiles heterocigotos donde uno de los alelos de cada muestra se presentaba fuera del rango de la escalera alélica del D18S51. El análisis de las secuencias de los alelos fuera del rango de la escalera reveló doce nuevos alelos que se designaron de acuerdo con el número de repeticiones AGAA de la siguiente forma: 28, 29, 30, 31, 32, 33 , 34, 35, 36, 37, 38 y 40. Adicionalmente se presentan dos investigaciones de paternidad en las que se observó mutaciones de un paso en D 18S51 que involucraban los alelos 28 -29 y 31-32. Los alelos fuera del rango de las escaleras alélicas tienen serias implicaciones para el análisis semiautomatizado de los STRs porque pueden ser causantes de falsa pérdida de heterocigosis y falsos patrones de tres alelos. Por esta razón, nuestra observación debe ser considerada en la evaluación...Item Patrones de expresión de los genes para las metalo B-Lactamasas BLA IMP-18 y BLA VIM-2 en la cepa Pseudomonas aeruginosa AG1 resistente a Carbapenems(2018) Chinchilla Montero, Diana; García Santamaría, FernandoItem Papel de la proteína Amp160 en la invasión y vida intracelular de Brucella abortus 2308 Wisconsin(2019) Jiménez Rojas, César Francisco; Guzmán Verri, CaterinaItem Desarrollo de un antiveneno preparado en gallinas contra el veneno de la serpiente Oxyuranus scutellatus y su comparación con una formulación similar preparada con inmunoglobulinas equinas(2016) Navarro Arias, Diego; León Montero, Edwin GuillermoDebido a que la inmunogenicidad de una molécula depende entre otras cosas de la distancia filogenética entre el organismo del cual dicha molécula se deriva y el organismo cuyo sistema inmune quiere estimularse, es posible que los antivenenos producidos en gallinas tengan un perfil de inmunoreactividad menos diverso que el obtenido en caballos y consecuentemente podrian ser menos eficaces. Con el objetivo de comparar la respuesta por anticuerpos inducida por el veneno de taipán en caballos y gallinas para evaluar si la especie seleccionada como fuente de inmunoglobulinas afecta la efectividad, eficacia y seguridad de los antivenenos formulados con estos anticuerpos, se preparó un antiveneno empleando inmunoglobulinas Y (lgY) purificadas a partir de yemas de huevos de gallinas inmunizadas con el veneno de la serpiente Oxyuranaus scutellarus (taipán). Este antiveneno (AvDG) fue comparado con un antiveneno similar formulado con IgG equina (AvDC). En comparación con el AvDC, el AvDG mostró menor capacidad para reconocer la toxina oscutarina C, y a la sub-unidad ex de la taipoxina. Consecuentemente, el A vDG mostró menor capacidad neutralizante de la actividad coagulante in vitro y la letalidad del veneno. Por otro lado, el AvDG fue aproximadamente 17 veces más inmunogénico en conejos que el AvDC al ser administrado por vía intravenosa. Además, el AvDG fue aclarado más rápido que el AvDC. Las diferencias entre ambos antivenenos pueden estar relacionadas con la menor distancia filogenética entre serpientes y gallinas, comparada con la existente entre serpientes y caballos. Sin embargo, esta hipótesis necesita ser estudiada evaluando otros venenos, con el fin de detenninar si esto es una tendencia general. De ser este el caso, el uso de gallinas para producir anti venenos no seria tan eficaz como el uso de mamíferos. De igual forma, el hecho que las gallinas sean filogenéticamente más...Item Regeneración muscular en un modelo murino de gangrena gaseosa inducida con un inóculo subletal de Clostridium perfringens(2018) Zúñiga Pereira, Ana Mariel; Flores Díaz, MariettaClostridium perfringens, uno de los patógenos de humanos y animales más ampliamente distribuido en la naturaleza, es el agente causal más frecuente de la gangrena gaseosa en humanos. En la patogénesis de esta enfermedad, la fosfolipasa C y la perfringolisina O producidas por C. perfringens, actúan de manera sinérgica induciendo una severa mionecrosis. La regeneración del tejido muscular posterior a la mionecrosis ocurre en cuatro fases interrelacionadas: degeneración, inflamación, regeneración y remodelación; de ellas, la inflamación es claramente un componente crítico del proceso regenerativo. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la respuesta inflamatoria durante el daño y la regeneración muscular, en un modelo murino de gangrena gaseosa inducida con un inóculo subletal de lxl0 6 UFC de C. perfringens. Se determinó que el uso de dicho inóculo induce una lesión que es controlada antes de 24 horas. La infección genera daño vascular significativo durante las primeras 6 horas, lo que limita la migración de células inflamatorias. Un aumento significativo de las citoquinas pro inflamatorias IL 1ß, IL6 y TNF a, desde las 6 horas hasta las 48 horas postinfección, se asocia a la presencia de infiltrado inflamatorio; sin embargo, la ausencia de la expresión de IFNy, un bajo número de macrófagos Ml en su pico máximo (142.60±18.21 células por mm 2) en comparación con el de PMNs (548.40±56.40 células por mm2) y macrófagos M2 (616.20±179.40 células por mm2 ), una deficiente actividad fagocítica y la prolongación de la permanencia de células proinflamatorias hasta por 5 días, implican alteraciones en la respuesta inmune y la regeneración muscular. Aunque la infección induce extravasación de infiltrado inflamatorio, la bacteria permanece viable en el tejido hasta por al menos 9 días, lo cual tiene implicaciones clínicas importantes. Un aumento...